抗菌肽MAT28和RL4的抗真菌活性及機(jī)制研究.pdf

1、抗菌肽是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。它們是一類對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒以及腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抑制作用的小分子多肽，是新型抗生素開發(fā)的良好候選資源。
　　 本課題采用NCCLS推薦的M27-A2方案，以臨床對(duì)氟康唑耐藥的白念珠菌作受試菌株，通過微量液基稀釋法對(duì)31條動(dòng)物抗菌肽進(jìn)行體外抗耐藥真菌活性測(cè)定，結(jié)果顯示其中僅抗菌肽RL4和MAP28對(duì)受試耐藥菌株都表現(xiàn)出明顯且穩(wěn)定的抑菌活性(MIC80分別為12.2μM，9.4μM)，其

2、余抗菌肽活性較弱（MIC80值范圍為20.2～57.1μM）或是未表現(xiàn)出抑菌活性。當(dāng)通過棋盤式微量液基稀釋法，將31條抗菌肽與氟康唑聯(lián)合進(jìn)行抗耐藥白念珠菌活性測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅RL7、LR5、LR7與氟康唑合用對(duì)一株耐藥白念珠菌顯示出一定的協(xié)同作用(FICI＜0.5)，其余抗菌肽與氟康唑合用表現(xiàn)為相加或無(wú)關(guān)。基于抗菌肽RL4和MAP28對(duì)氟康唑耐藥菌具有良好的抗菌活性，本課題全面考察了RL4和MAP28對(duì)真菌的抗菌作用并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初

3、步探討，為抗真菌耐藥研究提供新思路。
　　 首先，微量液基稀釋法測(cè)定結(jié)果表明抗菌肽RL4和MAP28對(duì)多種真菌均具有良好的抗真菌活性，MIC80值的范圍分別為6.1～48.8μM和2.32～18.8μM，尤其對(duì)一些唑類耐藥菌，RL4和MAP28的抗菌活性都比氟康唑高。瓊脂平板紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RL4和MAP28的抗菌活性。最低殺菌濃度的測(cè)定和時(shí)間殺菌曲線實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一定濃度下RL4和MAP28都表現(xiàn)出殺菌作用。多肽作用后胞內(nèi)PI(P

4、ropidium Iodide)熒光強(qiáng)度的測(cè)定證實(shí)了RL4和MAP28在短時(shí)間內(nèi)可發(fā)揮抗真菌的作用。同時(shí)菌絲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)RL4和MAP28對(duì)耐藥菌菌絲的形成具有抑制作用。
　　 本課題進(jìn)一步通過對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌細(xì)胞膜通透性改變和氧化損傷作用等方面的分析，考察了RL4和MAP28抗白念珠菌的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明:RL4對(duì)胞內(nèi)鉀離子的外排沒有顯著性影響，但會(huì)引起耐藥菌胞內(nèi)生物大分子的外泄，并能快速改變細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)PI進(jìn)

5、入胞內(nèi)，發(fā)揮抗真菌作用。電鏡觀察結(jié)果可見，RL4作用后細(xì)胞膜皺縮，部分真菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜形成明顯的裂口。而MAP28可迅速促進(jìn)胞內(nèi)鉀離子外排，同時(shí)可快速引起胞內(nèi)生物大分子的外泄，引起膜通透性改變，發(fā)揮抗菌作用;電鏡觀察結(jié)果可見細(xì)胞膜破壞嚴(yán)重，且胞內(nèi)FITC標(biāo)記MAP28的綠色熒光可時(shí)間依賴性增強(qiáng)。此外MAP28能夠劑量依賴性的升高白念珠菌內(nèi)源性活性氧水平，降低線粒體膜電位;且低濃度MAP28能夠促進(jìn)真菌細(xì)胞凋亡，高濃度MAP28直接殺