外源基因GFP在白三葉草生物反應(yīng)器系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的研究.pdf

1、在我們的研究中,能夠定量地分析比較植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的差異非常重要.因此,我們以此為突破點,試圖從多方面尋找提高cDNA合成的質(zhì)量、數(shù)量和穩(wěn)定性的方法.眾所周知,cDNA合成過程對于定量研究轉(zhuǎn)錄水平存在重要影響,而且其數(shù)量和質(zhì)量也直接影響定量的精確性.所以,我們以α-Tubulin作為研究對象,利用半定量PCR和實時PCR相結(jié)合來評價不同引物以及其工作濃度和DTT的存在對于cDNA合成的影響.為了建立模式系統(tǒng),我們構(gòu)建了兩個表達(dá)載體

2、,Double35S-GFP和-90-GFP.在GFP編碼區(qū)前面引入了一段具有很強功能的翻譯啟始保守序列,其中-3位的A和+4位的G符合Kozak consensus,-10 A則是能夠特異性地提高白三葉細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)基因翻譯效率的保守位點.同時兩個新的酶切位點ClaI,XhoI也被引入到GFP的5'UTR末端,以后將在此處插入新的功能序列以便研究UTR的二級結(jié)構(gòu)對GFP表達(dá)的影響.將這兩個表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌,獲得的農(nóng)桿菌菌株AGL1pS

3、oup-pG0020和AGL1pSoup-pG0023用來轉(zhuǎn)化白三葉草葉片.我們還從白三葉草植物基因組DNA中克隆獲得了Tubulin基因家族的3個新的DNA片段.它們是793 bps的Tubulin 2(GenBank accession number:AY569008),755 bps的Tubulin 4(GenBank accession number:AY570543)和717 bps的Tubulin 7(GenBank acc