凋亡相關基因APR3轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的初步研究.pdf

1、基因表達調(diào)控在機體適應環(huán)境，個體發(fā)育分化，細胞生長和增殖等方面具有重要的生物學意義。真核生物的基因表達在基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后修飾，翻譯，翻譯后加工等水平受到嚴格精密的調(diào)控，研究基因的表達調(diào)控將為人類認識自身和征服疾病提供重要的信息。在上述眾多的基因表達調(diào)控環(huán)節(jié)中，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控無疑是基因表達的最基礎的調(diào)控點。 新基因APR3 是1999 年本研究室在研究全反式維甲酸誘導HL-60 細胞分化、凋亡時克隆得到的，因其可能參與了維甲酸誘

2、導的HL-60 的凋亡過程，故命名為凋亡相關基因3（apoptosis related protein 3）。該基因存在兩種轉(zhuǎn)錄本，編碼兩種不同的蛋白。目前，尚無關于該基因的功能報道，因此研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，有望為該基因參與的生物學功能提供有價值的線索。 本研究在全面分析現(xiàn)有的關于APR3 的信息的基礎上，發(fā)現(xiàn)了該基因兩個轉(zhuǎn)錄本的差異，通過PCR 擴增該基因上游大約1000bp 的序列，并克隆到pGL3 載體中，根據(jù)熒光報

3、告系統(tǒng)讀數(shù)，結合RT-PCR 確定了該基因的啟動子區(qū)；利用生物信息學手段，通過系列截短體的構建，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NFAT 對該基因有調(diào)控作用，并找到了相應的順式作用元件，提示該基因可能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)新基因APR3 可能受TNFα的下調(diào)。 具體來說，本研究的主要結論如下： 1. 與以往認為的該基因的兩種轉(zhuǎn)錄本是通過基因的可變剪接生成的不同，我們的實驗發(fā)現(xiàn)該基因5’上游調(diào)控區(qū)含有兩個啟動子區(qū)，通過系列

4、截短體的構建，我們將兩個啟動子定位于該基因的-245/-173 和-113/+148 處，分別負責兩種轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄。因此，和以往認為的該基因兩轉(zhuǎn)錄本具有相同的轉(zhuǎn)錄起始點不同，我們認為該基因具有不同的轉(zhuǎn)錄起始點，不同引物RT-PCR 結果進一步驗證了我們的結果。 2. 以生物信息學為指導，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NFAT 和NFκB對目標基因有調(diào)控作用；通過構建系列截短體，我們發(fā)現(xiàn)-254/-113 含有轉(zhuǎn)錄因子NFAT 的結合位點，通過

5、突變體的構建，發(fā)現(xiàn)生物信息學預測的兩個結合位點都是功能性的位點。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Rel 家族的另一主要成員NFκB/p65，與NFAT 不同，對目的基因有抑制作用。 綜上所述，我們的工作發(fā)現(xiàn)了APR3 基因的兩個啟動子區(qū)負責該基因的轉(zhuǎn)錄，證明了重要轉(zhuǎn)錄因子NFAT和NFκB/p65 對該基因有明確的調(diào)節(jié)作用，預示著該基因可能參與NFAT 和NFκB/p65 相關的重要的生理或病理過程，為深入研究該基因的生物學功能提供了有價值的信