抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因GmDREB3轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制的.pdf

1、DREB（dehydration resistance element binding protein）類轉(zhuǎn)錄因子是一類與抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，廣泛存在于各種植物中，參與調(diào)控各種與抗逆相關(guān)的功能基因的表達(dá)，在逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)過程中發(fā)揮非常重要作用。但是，目前對(duì)DREB基因的研究主要集中在功能分析方面，對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制了解比較少。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)從大豆中克隆到新的GmDREB3基因，功能研究表明，過表達(dá)GmDREB

2、3基因可以顯著提高植物的抗逆性。將GmDREB3啟動(dòng)子分段缺失融合GUS報(bào)告基因采用基因槍轉(zhuǎn)化小麥成熟胚愈傷組織，利用瞬時(shí)表達(dá)的方法檢測(cè)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的活性的方法，對(duì)GmDREB3啟動(dòng)子進(jìn)行初步分析證明，在啟動(dòng)子的-705～-1117bp區(qū)域存在著低溫和干旱響應(yīng)的正調(diào)控元件，在-1117～-1464bp區(qū)域存在著對(duì)低溫和干旱響應(yīng)的負(fù)調(diào)控元件。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)這兩個(gè)重要區(qū)域進(jìn)行了細(xì)致分析，結(jié)果證明在-705～-731bp區(qū)域存在著對(duì)低

3、溫和干旱響應(yīng)的正調(diào)控MYB元件；-1117～-1269 bp區(qū)域存在著對(duì)低溫和干旱響應(yīng)起重要作用負(fù)調(diào)控MYC元件。本研究中我們利用確定的重要調(diào)控元件分別構(gòu)建了誘餌載體，采用酵母單雜交技術(shù)，分別篩選與重要調(diào)控元件結(jié)合的上游調(diào)控蛋白：運(yùn)用MYC元件做誘餌篩選到了GmERF蛋白，運(yùn)用MYB元件作誘餌篩選到了GmMYB蛋白。我們分別采用酵母單雜交技術(shù)和凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MYC元件與ERF元件可以和GmERF蛋白結(jié)合，MYB元件可以和GmMYB

4、蛋白結(jié)合；通過酵母轉(zhuǎn)化驗(yàn)證GmMYB蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性，而GmERF蛋白不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。通過RT-PCR對(duì)低溫處理不同時(shí)間的擬南芥中的GmERF和GmMYB基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)表達(dá)量GmMYB呈下降趨勢(shì)，GmERF呈上升趨勢(shì)，一段時(shí)間后兩者的表達(dá)量趨于穩(wěn)定；通過酵母體內(nèi)的兩個(gè)蛋白之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明在GmMYB蛋白和GmERF蛋白表達(dá)量一致的情況下，GmERF蛋白先與GmDREB3啟動(dòng)子結(jié)合。為了確定GmERF和

5、GmMYB基因的功能，我們分別構(gòu)建了侵染植物的表達(dá)載體，結(jié)果分析表明，轉(zhuǎn)GmMYB基因的擬南芥能明顯提高植株的對(duì)干旱、NaCl等逆境脅迫的能力，轉(zhuǎn)GmERF基因的擬南芥對(duì)干旱、鹽等的脅迫呈現(xiàn)敏感的趨勢(shì)。綜上所述，在大豆低溫處理3h內(nèi)，GmMYB蛋白與MYB元件結(jié)合，激活DREB3基因的表達(dá)，從而激活下游抗逆基因的表達(dá)；在低溫處理24h后，GmERF蛋白與MYC和ERF元件結(jié)合，抑制DREB3基因的表達(dá)，從而抑制下游抗逆基因的表達(dá)。正是由