流感病毒血凝素莖干部通用疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染性疾病。流感病毒屬正粘病毒科，根據(jù)NP蛋白和M蛋白的不同，流感病毒可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三種類型；根據(jù)HA和NA的不同，甲型流感病毒又可分為不同的亞型，其中HA可分為17個(gè)亞型， NA可分為10個(gè)亞型。流感病毒的亞型多，抗原變異頻繁，因而研制一種能夠應(yīng)對(duì)流感病毒快速變異，并具有廣泛保護(hù)作用的“通用型”疫苗具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究構(gòu)建了基于A/Puerto Rico/8/1

2、934(H1N1)流感病毒HA基因莖干部分的通用疫苗，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了評(píng)估。
　　試驗(yàn)一流感病毒HA基因莖干部分通用疫苗的構(gòu)建
　　本試驗(yàn)以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)流感病毒基因?yàn)槟０宀⒃O(shè)計(jì)4個(gè)引物，通過overlap PCR方法擴(kuò)增HA基因莖干部區(qū)域HA-stem，插入到pCAGGS載體的ClaI/BglII限制性酶切位點(diǎn)，陽性重組質(zhì)粒通過PCR、雙酶切及序列測定進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)

3、PCR鑒定于1060bp處擴(kuò)增出目的條帶，經(jīng)過雙酶切獲得1060bp的目的條帶及4746bp的載體條帶，經(jīng)序列測定發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒閱讀框正確，插入的片段與參考毒株CY146833.1的核苷酸序列同源性達(dá)到99％，氨基酸同源性100%，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pCAGGS-HA-stem。
　　試驗(yàn)二 pCAGGS-HA-stem體外表達(dá)與鑒定
　　將純化的真核表達(dá)載體pCAGGS-HA-stem0.5ug瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK

4、-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48h利用HA陽性血清進(jìn)行間接免疫熒光檢測，同時(shí)提取細(xì)胞總RNA，用DpnⅠ處理后進(jìn)行RT-PCR檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，并且能夠檢測到HA-stem的轉(zhuǎn)錄，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞并未出現(xiàn)熒光，表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒能在體外正常表達(dá)。
　　試驗(yàn)三小鼠免疫試驗(yàn)
　　將6~8周齡健康雌性 BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只。分為pCAGGS-HA-stem免疫組

5、及實(shí)驗(yàn)室以前構(gòu)建的三個(gè)質(zhì)粒 pCAGGS-HA、pCAGGS-HA1、pCAGGS-HA2免疫組，以及3個(gè)對(duì)照組（pCAGGS空載體組對(duì)照組、PBS對(duì)照組、健康對(duì)照組）。免疫兩次。首次免疫在小鼠的雙側(cè)脛前肌注射50μg試驗(yàn)構(gòu)建的真核表達(dá)載體，30d時(shí)再次雙側(cè)脛前肌注射50μg。免疫當(dāng)天（第0天）與免疫后第60天進(jìn)行小鼠眼眶采血，測定其HI抗體效價(jià)、中和抗體效價(jià)及INF-γ水平。結(jié)果顯示，pCAGGS-HA、pCAGGS-HA1、pCAG

6、GS-HA2、pCAGGS-HA-stem四個(gè)免疫組對(duì) A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)病毒的HI抗體效價(jià)分別為1:25、1:24、1:25、1:25，中和抗體效價(jià)分別為32、19、27、24。對(duì)A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)病毒的HI抗體效價(jià)分別為1:24、1:23、1:23、1:26，中和抗體效價(jià)分別為22、13、24、22。pCAGGS-HA、pCAGGS-HA2、pCAGGS-HA-

7、stem、pCAGGS、PBS五個(gè)組第0天INF-γ含量分別為1776.59±191.27、1777.97±252.50、1791.47±151.17、1778.65±54.14、1780.43±207.86。第60天INF-γ含量分別為2311.37±130.11、2362.40±98.24、2497.06±120.44、1799.23±65.01、1795.00±150.27。表明pCAGGS-HA-stem能夠誘導(dǎo)對(duì)異源流感病毒的