小鵝瘟病毒“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫原性分析.pdf

1、小鵝瘟（Gosling Plague,GP）是由小鵝瘟病毒（Goose Parvovirus,GPV）引起的以雛鵝和雛番鴨作為侵染對象，是一種高致病性傳染病并且以壞死性腸炎為主，對養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅。目前主要依靠弱毒疫苗免疫接種進行預(yù)防，雖然預(yù)防效果較好，但從血清學(xué)上較難區(qū)別疫苗免疫和野毒感染的動物，且理論上存在毒力反強的可能性。所以，開發(fā)安全、有效、并且能夠分別出是疫苗免疫還是野毒感染顯得尤為重要。VP3蛋白是GPV可以引起

2、保護性中和抗體的糖蛋白。本試驗構(gòu)建了基于VP3蛋白的“自殺性”DNA疫苗，并將重組質(zhì)粒免疫小鼠以及雛鵝，初步分析其免疫原性和保護效果。
　　首先，由GenBank所登錄的GPV標(biāo)準(zhǔn)株B株的序列，用Primer Premier軟件針對VP3開放閱讀框序列設(shè)計一對特異性引物，并在5’端添加了合適的酶切位點。提取GPV的DNA，經(jīng)過PCR成功獲得了VP3的基因片段。再將其克隆至甲病毒復(fù)制子載體pSCA1。通過PCR、酶切的鑒定及序列測定

3、篩選出陽性重組質(zhì)粒，并命名成pSCA-VP3。pSCA-VP3經(jīng)過轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Trans5α后，利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。再利用Lipofectamine-2000試劑盒轉(zhuǎn)染pSCA-VP3至BHK-21細(xì)胞，用間接免疫熒光和Western blotting試驗檢測VP3蛋白在體外的表達。結(jié)果表明：構(gòu)建了pSCA-VP3重組質(zhì)粒；間接免疫熒光和Western blotting試驗結(jié)果顯示VP3蛋白能在體外獲得表達，且具有良

4、好的反應(yīng)原性。
　　其次，把30只BALB/c小鼠（6周齡）隨機分為3組（10只/組），前兩組分別免疫pSCA-VP3和pSCA1空載體質(zhì)粒，首免劑量為100μg/只，以2周的間隔時間對小鼠進行3次免疫，劑量均為200μg/只，免疫途徑為腿部肌肉注射，同時設(shè)PBS對照組。于首免后0，2，4，6周分別采集小鼠外周血分離血清，通過間接ELISA檢測特異性抗體水平。免疫6周后無菌采集小鼠脾臟，進行淋巴細(xì)胞增殖試驗，檢測細(xì)胞免疫的水平。結(jié)

5、果表明：pSCA-VP3能夠引起小鼠產(chǎn)生較強的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且其免疫水平顯著高于pSCA1空載體及PBS陰性對照組。
　　最后，將無母源抗體的雛鵝（7日齡）分為4組（10只/組），分別免疫pSCA-VP3和pSCA1空載體質(zhì)粒，首免劑量是100μg/只，以2周的間隔時間對雛鵝進行2免，劑量是200μg/只，肌肉注射，同時設(shè)置弱毒疫苗和PBS陰性對照組。于首免后0，2，4周采集雛鵝外周血分離血清，通過血清中和試驗檢測雛鵝體內(nèi)

6、中和抗體水平。二免2周后對雛鵝采集抗凝血，進行淋巴細(xì)胞增殖試驗，檢測細(xì)胞免疫水平。二免2周后，每組雛鵝肌肉注射GPVYZ株病毒液100ELD50，觀察7天，是否出現(xiàn)相關(guān)臨床癥狀。如果有死亡的雛鵝，及時進行剖檢，觀察相關(guān)臟器的病變。通過相關(guān)內(nèi)臟組織的HE染色和免疫組化試驗分析組織的病理損傷和病毒在組織內(nèi)含量的情況。結(jié)果顯示：pSCA-VP3和弱毒苗組的雛鵝誘導(dǎo)產(chǎn)生了中和抗體，且顯著高于空載體和對照組，并且弱毒苗組的免疫效果比pSCA-VP

7、3組更好；其細(xì)胞免疫水平高于pSCA1空載體及PBS陰性對照組。攻毒試驗產(chǎn)生了較好的保護率，HE染色結(jié)果表明pSCA-VP3組和弱毒苗組的病理損傷小于pSCA1空載體及PBS對照組；免疫組化試驗結(jié)果表明pSCA-VP3組和弱毒苗組的病毒含量明顯少于pSCA1空載體及PBS對照組。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建了表達VP3蛋白的“自殺性”DNA疫苗。將pSCA-VP3免疫小鼠，檢測其產(chǎn)生的GPV特異性抗體水平和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，證明構(gòu)建