2型糖尿病患者Caveolin-3基因K15N突變蛋白分析及功能研究.pdf

1、目的：2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus，T2DM）的遺傳背景與基因多態(tài)性密切相關(guān)。Caveolin-3（Cav-3）是肌肉特異性蛋白，它可以調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)T2DM病人Cav-3基因外顯子存在多處變異位點(diǎn)。為了觀察Cav-3基因突變是否影響胰島素受體信號(hào)途徑，改變骨骼肌細(xì)胞糖代謝，從而參與T2DM的發(fā)病機(jī)制，我們將Cav-3 K15N突變基因?qū)隒2C12細(xì)胞，對(duì)其表達(dá)的突變蛋白進(jìn)行相關(guān)功

2、能研究。
　　方法：利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Cav-3第一外顯子K15N（KU971296）、D16H和N33N三個(gè)突變點(diǎn)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后選擇二級(jí)結(jié)構(gòu)改變明顯的K15N突變進(jìn)行研究。分別構(gòu)建陰性對(duì)照組、野生型組以及Cav-3 K15N突變組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞。G418篩選后，胰島刺激30min，運(yùn)用Western Blot技術(shù)和IF技術(shù)鑒定Cav-3、AKT、pAKT以及GLUT-4等蛋白的表達(dá)情況；在12h、24h測(cè)定C

3、2C12肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量和36h細(xì)胞內(nèi)糖原合成量。
　　結(jié)果：1.分析發(fā)現(xiàn)K15N、D16H屬于錯(cuò)義突變，N33N屬于同義突變。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Cav-3蛋白質(zhì)二級(jí)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)變?yōu)槁菪Y(jié)構(gòu)的有K15N和D16H兩個(gè)位點(diǎn)。
　　2.經(jīng)400μg/ml的G418篩選后，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。Westernblot鑒定證實(shí)篩選成功，組間轉(zhuǎn)染效率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.與野生型組相比，K15N突變使骨骼肌細(xì)胞Cav-3

4、蛋白總體表達(dá)降低,而且富集在細(xì)胞核周圍，細(xì)胞膜分布減少。其下游信號(hào)分子AKT磷酸化減少，但總AKT蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。細(xì)胞GLUT-4蛋白不僅總體表達(dá)水平下降，而且在細(xì)胞膜上聚集成團(tuán)。
　　4.Cav-3 K15N突變蛋白導(dǎo)致C2C12細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取減少。在12h，K15N突變組與陰性對(duì)照組和野生型組相比，p值分別等于0.042和0.000；在24h，K15N突變組與野生型組比較p=0.010，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是與陰性