紅樹(shù)林免疫增強(qiáng)真菌的篩選及菌株P(guān)H0016的鑒定.pdf

1、目的：
　　 從海南紅樹(shù)林土壤層中分離和篩選具有免疫增強(qiáng)活性的真菌菌株,以多種免疫學(xué)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)其活性,并通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段鑒定其種屬構(gòu)成,探討紅樹(shù)林真菌在免疫調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：
　　 用海水馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基對(duì)采集自紅樹(shù)林5～20cm土層的真菌菌株進(jìn)行分離及純化培養(yǎng),通過(guò)四氮唑藍(lán)(MTT)法對(duì)其發(fā)酵上清進(jìn)行免疫增強(qiáng)活性的篩選。對(duì)于具有免疫增強(qiáng)活性的菌株,進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)

2、行免疫學(xué)功能的評(píng)價(jià)。隨機(jī)將KM小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,分別給予真菌發(fā)酵上清物和生理鹽水灌胃10d后再進(jìn)行試驗(yàn),檢測(cè)項(xiàng)目包括小鼠免疫器官指數(shù)、溶血素測(cè)定、溶血空斑形成試驗(yàn)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)、巨噬細(xì)胞吞噬功能等。通過(guò)對(duì)菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察,結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行rDNA ITS序列的測(cè)定及同源性分析,通過(guò)BLAST比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育分析,確定其種屬分類(lèi)地位。
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)

3、±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示。對(duì)不同組別的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和組間的兩兩比較(SNK法),對(duì)小鼠灌胃前后的體重采用協(xié)方差分析,組間比較采用兩樣本的t檢驗(yàn),上述分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水平為0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、紅樹(shù)林真菌的分離及免疫增強(qiáng)菌株的篩選結(jié)果
　　 1.菌株分離結(jié)果:從東寨港紅樹(shù)林國(guó)家自然保護(hù)區(qū)土壤樣本中共分離得到真菌325株。
　　 2.MTT

4、法篩選活性菌株:用325株真菌的發(fā)酵上清對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行增殖刺激實(shí)驗(yàn),分別以PHA和基礎(chǔ)培養(yǎng)液作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12株具有促進(jìn)增殖作用,其中菌株P(guān)0016有較強(qiáng)效果。菌株P(guān)0016和陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組差異有顯著性意義(F=408.741,P=0.000),兩兩比較結(jié)果菌株P(guān)H0016發(fā)酵上清對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的增殖刺激作用顯著強(qiáng)于陰性對(duì)照組(P=0.000),而與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0

5、.073)。
　　 二、菌株P(guān)H0016的免疫增強(qiáng)活性評(píng)價(jià)
　　 1.PH0016活性效應(yīng)產(chǎn)物的粗提和檢測(cè):通過(guò)葡聚糖凝膠SephadexG-25柱層析法對(duì)菌株P(guān)H0016的發(fā)酵上清進(jìn)行粗提,共分離獲得20管提取物,再次以MTT法進(jìn)行免疫活性的檢測(cè),其中第6管的作用最強(qiáng),與陰性對(duì)照組的差異有顯著性意義(P=0.000),與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.135)。之后的KM小鼠體內(nèi)試驗(yàn)均以第6管提取物為樣品進(jìn)行。

6、r>　　 2.PH0016提取物對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀況和體重及臟器比值的影響:對(duì)小鼠灌胃前后的體重采用兩樣本的t檢驗(yàn)及協(xié)方差分析證實(shí),灌胃前實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重與對(duì)照組間比較無(wú)顯著性的差異(t=0.998,P=0.332),灌胃后兩組小鼠的體重亦無(wú)顯著性差異(F=1.037,P=0.324),說(shuō)明發(fā)酵上清的提取物對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)影響。灌胃后實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟/體重比值與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(t=1.878,P=0.078),說(shuō)明發(fā)酵上清的提取物對(duì)

7、小鼠的脾臟/體重比值無(wú)影響。
　　 3.PH0016提取物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響:兩樣本的t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示,經(jīng)灌服發(fā)酵上清凍干劑的小鼠足跖腫脹度明顯高于對(duì)照組,差異具有顯著性(t=3.858,P=0.001)。
　　 4.PH0016提取物對(duì)小鼠體液免疫功能的影響:兩樣本的t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示,PH0016提取物能明顯增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)組小鼠的HC50,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異具有顯著性(t=5.632,P=0.000

8、)；其PFC水平與對(duì)照組比較,差異也具有顯著性(t=2.855,P=0.008)。
　　 5.PH0016提取物對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響:鏡下觀察計(jì)數(shù)吞噬細(xì)胞吞噬情況時(shí)可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞內(nèi)的雞紅細(xì)胞較多,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,實(shí)驗(yàn)組的吞噬指數(shù)顯著高于對(duì)照組(t=3.268,P=0.003)。
　　 三、菌株P(guān)H0016的鑒定
　　 菌株在PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基3種固體培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好,在查氏培養(yǎng)基和P

9、DA培養(yǎng)基生長(zhǎng)7d左右直徑可達(dá)15 mm～18mm。菌落扁平、質(zhì)地疏松、粉絮狀、淡紫色。表面深紫色為產(chǎn)孢層,產(chǎn)孢旺盛,肉眼可見(jiàn)紫色孢子密集。菌落邊緣質(zhì)地疏松,呈白色。菌落背面顏色呈白色。光學(xué)顯微鏡下,營(yíng)養(yǎng)菌絲壁光滑,無(wú)色透明。分生孢子梗光滑無(wú)色,單個(gè)小梗直立于營(yíng)養(yǎng)菌絲上,瓶?；颗虼?孢梗上具2～4個(gè)瓶梗狀的輪生分枝。頂部錐形變細(xì),形成一薄的獨(dú)特的頸,分生孢子成向兩側(cè)分開(kāi)的鏈狀,有時(shí)纏在一起,分生孢子呈卵形或近球形,成熟后表面粗糙,透明

10、無(wú)色,成團(tuán)時(shí)呈紫色。以上特征與半知菌類(lèi)(Fungi Imperfecti),叢梗孢目(Moniliales),叢梗孢科(Moniliaceae),瓶梗青霉屬(Paecilomyces Bainier)的分類(lèi)特征相似。通過(guò)rDNA ITS序列分析和同源性檢索發(fā)現(xiàn),菌株P(guān)H0016與擬青霉屬相似性均為100％。因此,可以推斷菌株P(guān)H0016的有性世代為子囊菌綱(Ascomycetes)；肉座菌目(Hypocrealesl)；麥角菌科(Cla

11、vicipitaceae)；擬青霉屬(Paecilomyces)。
　　 結(jié)論：
　　 1.紅樹(shù)林土層中真菌資源豐富,本研究自東寨港紅樹(shù)林國(guó)家自然保護(hù)區(qū)土壤樣本中共分離得到真菌325株。其中12株具有免疫增強(qiáng)作用。
　　 2.針對(duì)菌株P(guān)H0016的免疫學(xué)檢測(cè)研究顯示,其活性成分提取物對(duì)小鼠的T、B淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的功能都具有明顯的增強(qiáng)作用。
　　 3.經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定手段,結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)

12、建,表明該菌屬于半知菌類(lèi)(Fungi Imperfecti),叢梗孢目(Moniliales),叢梗孢科(Moniliaceae),瓶梗青霉屬(Paecilomyces Bainier)；有性世代為子囊菌綱(Ascomycetes)；肉座菌目(Hypocreales)；麥角菌科(Clavicipitaceae)；擬青霉屬(Paecilomyces)。
　　 4.擬青霉屬包括的種類(lèi)豐富,分布廣泛,生物學(xué)功能多樣化,目前還沒(méi)有從紅樹(shù)