腫瘤抑制蛋白p53通過microRNAs調控B7-H1表達的研究.pdf

1、第一部分P53敲除A375細胞系的建立
　　目的：利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)建立p53敲除的細胞系
　　方法：設計兩條針對人的p53基因的gRNA，分別將兩條 gRNA插入pBT-U6-Cas9-2A-GFP表達質粒，然后將含有不同 gRNA的質粒分別轉染進入 K562細胞，用SUVEYOR突變檢測試劑盒，對兩條設計的gRNA的剪切效率進行比較，選取效率較高gRNA進行后續(xù)p53敲除。在A375細胞中轉染GFP標記含有g

2、RNA和CAS9核酸酶的質粒，驗證突變，同時流式分選出GFP陽性的細胞。將分選出的細胞，分別單個接種于96孔板，待其克隆形成。部分克隆形成之后，將其擴增傳代，形成單克隆細胞系。為從中篩選出p53敲除細胞，首先我們使用x-ray處理所有獲得克隆，然后免疫電泳檢測所有克隆中p53的表達情況，選出p53表達陰性的克隆進行測序，以驗證p53敲除的可靠性。同時也對X射線刺激細胞，然后對p53下游基因p21進行檢測，以在功能上確認p53的敲除。

3、r>　　結果：SUVEYOR結果顯示設計的兩條gRNA均可以造成突變，編輯效率第一條gRNA較好。使用gRNA1轉染A375細胞，SUVEYOR檢測到突變發(fā)生。Western檢測p53在各個克隆中的表達發(fā)現(xiàn)，在獲得的23個克隆中，有3個克隆在p53位置出現(xiàn)了缺失，敲除效率為3/23.同時使用PCR對敲除位點進行了擴增，相比正常WT p53條帶，所獲得疑似敲除克隆的p53條帶位置均發(fā)生了變化。測序結果顯示，所獲得三個陽性克隆p53基因段均

4、發(fā)生了明顯的基因插入或者缺失，導致了p53表達的失調。最后對p53下游基因p21的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)所獲克隆中，在p53已被激活的情況下，p21的表達全部缺失。
　　結論：利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)，成功敲除p53基因，獲得了穩(wěn)定遺傳的p53完全敲除和p53變異細胞株。
　　第二部分 p53通過microRNAs抑制B7-H1的表達
　　目的：研究p53敲除后是否對細胞B7-H1的表達造成影響以及通過何種機制影響其

5、表達
　　方法：分別用流式檢測A375，HCT116和其p53敲除前后的B7-H1表達；使用RT-PCR檢測 B7-H1的信使 RNA在 A375，HCT116和其 p53敲除細胞系中的表達；使用microRNA芯片檢測A375和A375Δp53細胞之間的microRNA表達差異，并結合B7-H1靶點預測，從而篩選出可能具有對B7-H1具有調控功能的microRNAs；將篩選出來的microRNAs mimics轉染A375Δp5

6、3細胞，觀察B7-H1在各個不同mimics轉染后的表達情況，選擇出調控B7-H1表達的microRNA；使用特異性inhibitors同mimics一同轉染A375Δp53細胞，以確認microRNA作用的特異性；使用qRT-PCR檢測A375，HCT116和其 p53敲除前后以及使用 siRNA敲除 p53之后的microRNA-34a以及microRNA-200b表達，以驗證p53對microRNA-34a以及microRNA-2

7、00b表達的調控作用，并使用免疫電泳對p53以及B7-H1的表達進行檢測。構建雙熒光報告載體驗證microRNA-34a以及microRNA-200b靶向作用于B7-H1的3UTR。
　　結果：當p53缺失時，通過流式檢測發(fā)現(xiàn)B7-H1的表達在A375，HCT116細胞中均明顯上升；之后，對B7-H1的信使RNA表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)p53的敲除，并不影響B(tài)7-H1 mRNA的表達，結果無顯著性差異；通過篩選，并結合靶向預測，我們

8、發(fā)現(xiàn)在p53敲除前后，有8個候選microRNAs可能調控B7-H1表達。轉染mimics后發(fā)現(xiàn)，microRNA-34a和microRNA-200b可下調B7-H1在A375Δp53細胞中的表達，差異明顯。在加入microRNA-34a和microRNA-200b inhibitors共轉染時，這種下調效果可被消除。實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在p53敲除或敲低的情況下，microRNA-34a和microRNA-200b表達明顯下降，同

9、時B7-H1的表達上調。雙熒光素報告載體檢測發(fā)現(xiàn)，microRNA-34a和microRNA-200b可特異性結合域B7-H1的3’UTR端調控轉錄。
　　結論：p53的敲除下調 microRNA-34a和 microRNA-200b的表達，從而抑制microRNA-34a和microRNA-200b對B7-H1信使RNA的作用，導致B7-H1蛋白表達上升。
　　第三部分 microRNA-34a和microRNA-200b

10、調控Jurkat增殖和細胞因子分泌
　　目的：研究microRNA-34a和 microRNA-200b通過調控 B7-H1分子從而影響 Jurkat細胞的功能，介導免疫抑制。
　　方法：培養(yǎng)Jurkat細胞，用TPA刺激，誘導其表達PD-1受體，免疫電泳檢測誘導表達效果；將誘導表達PD-1的Jurkat細胞同A375Δp53細胞共培養(yǎng)，利用B7-H1阻斷性抗體抑制 B7-H1/PD-1通路的激活，觀察 Jurkat細胞的增

11、殖情況。在使用microRNA-34a和microRNA-200b的mimics和inhibitors分別轉染A375Δp53細胞后同Jurkat細胞共培養(yǎng)，以觀察microRNA-34a和microRNA-200b對細胞造成的增殖改變。同時收集共培養(yǎng)細胞的上清培養(yǎng)液，檢測microRNA-34a和microRNA-200b對細胞分泌IFN-gamma，IL-2細胞因子的影響。
　　結果：jurkat細胞在 TPA刺激后，其 PD

12、-1的表達明顯增強。將刺激后的細胞同A375Δp53細胞共培養(yǎng)，其增殖受到明顯抑制，在用B7-H1抗體阻斷后，此種增值抑制效應可以得到解除；同時，結果顯示，A375Δp53細胞相對于A375細胞更能明顯抑制Jurkat細胞增殖。在A375Δp53細胞中轉染進microRNA-34a和microRNA-200b的mimics后可以部分消除對Jurkat細胞的增殖抑制效應，加入對應inhibitors，可以恢復對Jurkat細胞的抑制。同時

13、對細胞因子的檢測發(fā)現(xiàn)，A375Δp53細胞表達B7-H1抑制Jurkat細胞的細胞因子分泌，microRNA-34a和microRNA-200b的mimics轉染可以有效解除抑制效果，共轉染對應inhibitors可以使得分泌再次被抑制。
　　結論：PD-1/B7-H1通路的激活可以抑制Jurkat細胞的增殖。A375Δp53細胞相比A375細胞具有更強的免疫抑制能力，此種抑制效應同microRNA-34a和microRNA-20