乙型肝炎病毒X蛋白上調(diào)共抑制分子B7-H1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)為部分雙鏈環(huán)狀DNA的嗜肝病毒，HBV感染可致急、慢性肝炎，持續(xù)HBV感染同原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的進(jìn)展密切相關(guān)。目前全球有3.5億HBV慢性攜帶者，每年約1百萬死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化、原發(fā)性肝癌。
　　 早期研究認(rèn)為HBV病毒DNA整合肝細(xì)胞基因組可激活癌基因或失活抑癌基因，從而誘發(fā)肝癌，但其致癌作用未得到

2、完全證實(shí)。對(duì)HBV病毒基因組的研究表明，HBV基因組主要翻譯4種蛋白，即：HBV多聚酶蛋白(HBP)、表面抗原(HBS)、核心抗原(HBC)及X蛋白(HBx)。一些體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，HBx可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及癌變；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究也發(fā)現(xiàn)X基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可誘發(fā)肝癌(HCC)的發(fā)生。進(jìn)一步的研究則提示，HBx本身并不具備直接的致癌效應(yīng)，而是作為反式激活因子并有效地激活胞內(nèi)的AP-1、AP-2、ATF/CREB、NF-kB、c/EBP、PI-

3、3K及Egr-1等多種效應(yīng)分子及信號(hào)傳導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)肝癌形成。此外HBx與p53蛋白結(jié)合后，在蛋白水平使靶細(xì)胞中抑癌基因及其產(chǎn)物的功能發(fā)生改變；并可通過影響正常的細(xì)胞周期，干擾DNA的修復(fù)及調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在HBV病毒感染及原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。雖然有關(guān)HBx在HBV誘發(fā)肝癌中的研究取得了一定地進(jìn)展，但HBx如何誘導(dǎo)HCC的發(fā)生，其確切的機(jī)制尚未清楚。
　　 共刺激分子是一類細(xì)胞膜表面分子，其

4、可為T、B細(xì)胞的活化提供輔助信號(hào)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、活化及分化。而缺乏共刺激信號(hào)的抗原刺激易引起T細(xì)胞的耐受、無反應(yīng)性和細(xì)胞調(diào)亡。最近，在共刺激分子與腫瘤相互關(guān)系的研究中，人們的注意力集中在了新型的B7家族共刺激分子尤其是B7-H1的身上。B7-H1是近年發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)T細(xì)胞的活化及存活起重要調(diào)節(jié)作用的共刺激分子。對(duì)腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1廣泛表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞并通過B7-H1/PD-1途徑誘導(dǎo)腫瘤的免疫逃避，B7-H1引起的效應(yīng)性細(xì)胞

5、凋亡是腫瘤細(xì)胞免疫逃避的一種重要機(jī)制。近來研究發(fā)現(xiàn)B7-H1高表達(dá)的肝癌病人比低表達(dá)的病人不良預(yù)后幾率顯著增加，提示B7-H1可能是肝癌病人復(fù)發(fā)的一種新的預(yù)測(cè)分子。
　　 很明顯HBx和B7-H1均參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)病進(jìn)程，然而它們?cè)诟伟┌l(fā)生過程中是否存在某種聯(lián)系?德國雷根斯堡大學(xué)研究小組證實(shí)HBV感染肝細(xì)胞后上調(diào)B7-H1的表達(dá)，而HBx在HBV復(fù)制中起重要作用，因此我們提出這種假設(shè)：HBx可能通過激活B7-H1信號(hào)促進(jìn)肝癌的

6、形成。為了驗(yàn)證這種假設(shè)，首先我們根據(jù)adr亞型HBV基因組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增HBV x基因的PCR引物，擴(kuò)增HBV x基因片段，與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建重組子，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后命名為pcDNA3.1(+)/HBx。轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞經(jīng)抗生素G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)HBV X蛋白的HepG2細(xì)胞系，命名為HBx+-HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞系命名為HBx--HepG2細(xì)胞，并經(jīng)細(xì)胞免疫

7、化學(xué)染色、Western-blotting及細(xì)胞流式技術(shù)分析鑒定HBV x蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。然后我們利用基因芯片技術(shù)，分析HBx轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株引起的表達(dá)譜變化，所用芯片為Operon公司的35k human Genome Array，利用該芯片對(duì)HBx+-HepG2和HBx--HepG2細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的35000個(gè)基因中，其中有98個(gè)基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，24個(gè)基因轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)。這些差異顯著的基因?qū)儆诓煌念愋?，?/p>

8、僅包括癌基因及抑癌基因，還有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，信號(hào)分子，細(xì)胞黏附分子及編碼骨架蛋白的基因。有趣的是，對(duì)基因芯片分析后發(fā)現(xiàn)HBx能明顯上調(diào)肝癌細(xì)胞B7-H1基因轉(zhuǎn)錄，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，蛋白免疫印跡及流式細(xì)胞儀分析表明HBx也促進(jìn)HepG2細(xì)胞B7-H1蛋白的表達(dá)。最終確定HBV X蛋白上調(diào)了B7-H1在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證HBV X蛋白對(duì)共抑制分子B7-H1表達(dá)的上調(diào)作用，采用細(xì)胞流式技術(shù)分析PLC/C4細(xì)

9、胞系中共抑制分子B7-H1的表達(dá)，同樣得到HBV X蛋白的表達(dá)上調(diào)共抑制分子在PLC細(xì)胞的表達(dá)的結(jié)果，而X基因被干擾的C4細(xì)胞B7-H1未上調(diào)表達(dá)。
　　 那么HBx通過何種機(jī)制上調(diào)肝癌細(xì)胞B7-H1的表達(dá)呢?大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在HBx對(duì)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮重要作用。HBx通過激活NF-κB途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞上調(diào)各種基因的表達(dá)，如TNF-α、淋巴毒素α，啟動(dòng)子分析提示B7-H15’啟動(dòng)子非編碼區(qū)有幾個(gè)NF-κB結(jié)合

10、位點(diǎn)，有研究表明NF-κB在亞溶破攻膜復(fù)合物C5b-9誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞上B7-H1的表達(dá)及IFN-γ誘導(dǎo)皮膚纖維原細(xì)胞上的B7-H1表達(dá)中起重要作用。本研究我們也試圖確定是否HBx誘導(dǎo)B7-H1的mRNA的轉(zhuǎn)錄依賴于NF-κB的作用。我們首先PCR擴(kuò)增B7-H15’啟動(dòng)子非編碼區(qū)基因片段，并插入到含有熒光素酶報(bào)告基因的載體pGL3-Basic中構(gòu)建重組子，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后分別命名為p88，p175，p203，p398，p723，p

11、960。將以上重組子分別轉(zhuǎn)染HBX+-HepG2、HBx--HepG2細(xì)胞。熒光素酶活性分析表明與HBx--HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染HBx+-HepG2細(xì)胞48h后B7-H1啟動(dòng)子上游2405bp至175bp區(qū)域熒光素酶的活性明顯升高。然而轉(zhuǎn)染重組子p88后，熒光素酶的活性顯著下降。通過GenomeNet我們分析B7-H1啟動(dòng)子上游175bp內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)NF-κB基序結(jié)合位點(diǎn)。我們突變了B7-H1啟動(dòng)子上游175bp

12、內(nèi)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，并將該突變的重組子轉(zhuǎn)染HBx+-HepG2細(xì)胞。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染含NF-κB突變位點(diǎn)的重組子其B7-H1啟動(dòng)子活性下降約70-80％。此外，我們分別在HBx--HepG、HBx+-HepG2細(xì)胞加入核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB抑制劑PDTC作用24h后，Western-blot分析B7-H1的表達(dá)，結(jié)果顯示加入PDTC作用24h后HBx+-HepG2細(xì)胞表達(dá)B7-H1水平顯著下降，以上證實(shí)HBx誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞上

13、B7-H1的表達(dá)主要通過NF-κB途徑。
　　 大量研究已證實(shí)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的B7-H1促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡。為分析HBx誘導(dǎo)表達(dá)的B7-H1對(duì)T細(xì)胞凋亡的影響，我們首先從健康人的外周血分離PBMC，采用磁化細(xì)胞分離器分離法分離初始T細(xì)胞，用相應(yīng)的CD3、CD28單抗激活初始T細(xì)胞，分別將HBx+-HepG2和HBx--HepG2細(xì)胞與活化的T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)72h后，收集T細(xì)胞，annexin-V和PI雙染，流式分析T細(xì)胞凋亡率

14、。結(jié)果顯示與HBx--HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)相比，T細(xì)胞與HBx+-HepG2共培養(yǎng)后凋亡率明顯增加。有趣的是，在共培養(yǎng)之前加入B7-H1中和性抗體時(shí)，T細(xì)胞凋亡顯著下降，證實(shí)HBx誘導(dǎo)的B7-H1信號(hào)促進(jìn)了共培養(yǎng)系統(tǒng)中T細(xì)胞的凋亡。
　　 綜上所述，本研究分析了HBx與B7-H1在肝癌形成中的潛在聯(lián)系，我們利用人的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染含HBx基因的質(zhì)粒后能穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白?；蛐酒岸繉?shí)時(shí)PCR均證實(shí)與轉(zhuǎn)染空載

15、體的HepG2細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2細(xì)胞其B7-H1 mRNA的水平顯著增加。流式與蛋白免疫印跡進(jìn)一步證實(shí)HBx+-HepG2細(xì)胞其B7-H1蛋白水平明顯增加。構(gòu)建含B7-H1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析表明B7-H1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的128與137 bp之間的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)可能在HBx誘導(dǎo)B7-H1表達(dá)起一定作用，定點(diǎn)突變及阻斷試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB在HBx誘導(dǎo)B7-H1表達(dá)起主要作用。