創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫層析試紙條研制.pdf

1、背景和目的：創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌屬第5群細(xì)菌,革蘭氏陰性,彎曲有莢膜的弧菌,主要生長(zhǎng)在海水魚(yú)類(lèi)及貝母類(lèi)。根據(jù)其生化特性、流行病學(xué)模式以及宿主范圍將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ13個(gè)亞型,其中Ⅰ型Vv是導(dǎo)致人群創(chuàng)傷感染及原發(fā)性敗血癥的病原體。創(chuàng)傷弧菌感染一旦出現(xiàn)敗血癥,其病死率高達(dá)50％以上。原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)1990年首次報(bào)道一例,隨后沿海各地區(qū)每年都有散發(fā)病例報(bào)道,其病死率一直居高

2、不下。對(duì)本病的認(rèn)識(shí)不足,發(fā)病早期未能正確診斷,或誤診為超敏反應(yīng)而使用大劑量激素,是造成高病死率的主要原因。
　　 在對(duì)創(chuàng)傷弧菌感染的診斷方面,由于創(chuàng)傷弧菌引起的腹瀉及最初的癥狀并無(wú)特異性,因而實(shí)驗(yàn)室診斷成為最可靠的確診手段。目前細(xì)菌性食物中毒(包括創(chuàng)傷弧菌引起的食物中毒)的檢驗(yàn)仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主,但該方法操作繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,一般要經(jīng)過(guò):①增菌；②選擇性增菌；③選擇性平板分離；④生化鑒定；⑤血清學(xué)鑒定。耗時(shí)較長(zhǎng),往往需要4天～7天

3、甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能作出最終鑒定,且陽(yáng)性率低,容易造成漏檢。而創(chuàng)傷弧菌感染具有起病急、迅速致死的特點(diǎn),有臨床資料表明,住院到死亡時(shí)間平均為2天。因此迫切需要建立一種準(zhǔn)確而又迅速的診斷方法。目前已建立了不少創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)技術(shù),包括常規(guī)及復(fù)合PCR、核酸雜交、生物傳感器以及利用單克隆抗體建立的ELISA、乳膠凝集試驗(yàn)等技術(shù)方法。Parker等建立了以創(chuàng)傷弧菌特異性抗體為基礎(chǔ)的酶免疫法,最低檢出量為2000個(gè)菌/孔,但操作繁瑣,條件要求較多,一般需

4、要3～5 h才能完成檢測(cè)。PCR檢測(cè)方法的靈敏度高,文獻(xiàn)報(bào)道以創(chuàng)傷弧菌毒力相關(guān)基因vcg為目標(biāo)序列,設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)環(huán)境中的創(chuàng)傷弧菌,靈敏度可達(dá)2.5x103 CFU/ml,且具有良好的特異性,但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高,不適合現(xiàn)場(chǎng)檢查所需。
　　 能否建立一種快速方便的檢測(cè)方法,及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)創(chuàng)傷弧菌污染及感染進(jìn)行分析,為食品安全及臨床診斷提供有效證據(jù)呢?能否用試紙條對(duì)創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行快速檢測(cè)呢?國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相應(yīng)方法報(bào)道,為此

5、我們進(jìn)行了研究,目的是建立一種適合于創(chuàng)傷弧菌簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果易于判斷的檢測(cè)方法。
　　 方法:
　　 1.創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體的純化及鑒定
　　 (1)創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27562,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所普通微生物保藏中心。復(fù)蘇培養(yǎng)后,進(jìn)行革蘭氏染色,油鏡觀察,劃線接種于MarieBroth2216瓊脂平板,觀察其菌落形態(tài)。平板培養(yǎng)獲得獲得細(xì)菌,并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算出細(xì)菌濃度,并通過(guò)甲醛固定法制備創(chuàng)傷弧菌菌

6、體抗原。
　　 (2)以創(chuàng)傷弧菌全菌抗原多次免疫新西蘭大白兔,制備兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體。采用辛酸-飽和硫酸銨法對(duì)多克隆抗血清進(jìn)行純化；BCA法檢測(cè)純化后抗體蛋白濃度；SDS-PAGE法檢測(cè)抗體蛋白的純度,與純化前蛋白條帶的變化進(jìn)行比較；PMSF法制備創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白,Western-Blotting法檢測(cè)抗體蛋白與細(xì)菌外膜蛋白免疫反應(yīng)結(jié)果,觀察抗體蛋白的活性；間接ELISA法檢測(cè)純化前后抗體蛋白的效價(jià)的變化。
　　 2

7、.膠體金抗體探針的合成
　　 (1)根據(jù)試紙條的側(cè)向流動(dòng)和膠體金的示蹤功能,結(jié)合免疫學(xué)方法,建立創(chuàng)傷弧菌免疫層析試紙條。首先制備不同粒徑的膠體金顆粒,采用檸檬酸三鈉還原法,利用不同體積的還原劑制備五種不同粒徑的膠體金顆粒,紫外.可見(jiàn)光分光光度儀對(duì)上述膠體金進(jìn)行400nm～700nm的光譜掃描,獲得最大的吸收波長(zhǎng)、吸光值以及中位峰寬,并通過(guò)最大吸收峰波長(zhǎng)計(jì)算出膠體金顆粒粒徑的大小。觀察不同粒徑膠體金的顏色,透明性及穩(wěn)定性,選擇合適

8、的膠體金顆粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 (2)利用不同體積的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值,偶聯(lián)抗體蛋白,檢測(cè)520nm和580nm吸光度A比值,即A520nm/A580nm比值,繪出K2CO3體積-吸光度變化曲線,確定最適K2CO3的體積；以K2CO3調(diào)節(jié)pH后的膠體金溶液,偶聯(lián)不同體積的抗體蛋白,檢測(cè).A520nm/A580nm.比值,繪出蛋白抗體體積-吸光度變化曲線,確定最適抗體蛋白所需量。
　　 (3)對(duì)金標(biāo)抗體溶液

9、穩(wěn)定劑及緩沖液進(jìn)行優(yōu)化比較,選擇能有效保持金標(biāo)溶液穩(wěn)定性及活性的條件。
　　 3.創(chuàng)傷弧菌快速檢測(cè)試紙條研制
　　 (1)將純化的兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體和羊抗兔IgG分別包被在硝酸纖維素膜檢測(cè)線和質(zhì)控線上,并經(jīng)封閉液處理,干燥。玻璃纖維素膜浸泡于膠體金-抗體復(fù)合物后,選擇適合的干燥條件。將吸水紙,硝酸纖維素膜,金標(biāo)墊以及樣品墊依次粘貼至膠板上,組裝裁剪成試紙條。對(duì)創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫層析試紙條的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)對(duì)創(chuàng)傷

10、弧菌檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的觀察及LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)定量分析比較,確定制備試紙條最佳條件。
　　 (2)將試紙條插入樣品懸液中,待樣品層析完畢后觀察檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)線及質(zhì)控線處各出現(xiàn)一條紅線,則表示待檢樣品中有創(chuàng)傷弧菌,判為陽(yáng)性；若僅在質(zhì)控線處出現(xiàn)一條紅線,則判為陰性；若質(zhì)控線不出現(xiàn)紅線,則表示測(cè)試失效。根據(jù)試紙條檢測(cè)結(jié)果對(duì)本試紙條的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　 (3)建立ELISA以及試紙條檢測(cè)方法的

11、標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行實(shí)際樣品中創(chuàng)傷弧菌添加回收試驗(yàn)。
　　 (4)利用常規(guī)培養(yǎng)及生化鑒定方法從水產(chǎn)品中分離弧菌菌株,并進(jìn)行試紙條檢測(cè)試驗(yàn)。
　　 結(jié)果：創(chuàng)傷弧菌1.1758株在mariebroth2216瓊脂平板上為黃白色粘液半透明菌落,染色后觀察,革蘭氏染色陰性,彎曲,桿狀,多形性。
　　 1.創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體的純化及鑒定創(chuàng)傷弧菌免疫新西蘭大白兔,獲得兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體血清。以辛酸-飽和硫酸銨法純化抗體血清,根

12、據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度及其相應(yīng)的吸光度值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)所測(cè)得的稀釋樣品的吸光度值,計(jì)算出相應(yīng)的蛋白樣品濃度為12.5mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析驗(yàn)證在凝膠55kDa～61kDa之間出現(xiàn)蛋白條帶,純度較高。Western-Blotting檢測(cè),抗體蛋白能有效地與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白有效結(jié)合。經(jīng)間接ELISA檢測(cè),純化后抗體蛋白效價(jià)為1:12800。
　　 2.膠體金抗體探針的合成以檸檬酸三鈉還原法獲得五種不同粒徑大小的膠體金顆

13、粒,分別為54.88nm、36.15nm、36.15nm、17.42nm、12.74nm,通過(guò)比較觀察不同粒徑膠體金的顏色,透明性,穩(wěn)定性及標(biāo)記難易程度,金標(biāo)抗體活性質(zhì)量,選擇最大吸收峰波長(zhǎng)為520nm,粒徑大小為12.7nm的膠體金顆粒進(jìn)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。通過(guò)吸光度A520nm/A580nm曲線比較試驗(yàn),確定制備膠體金抗體最優(yōu)體系為:每1ml膠體金加入9μ10.1mol/L K2CO3及36μg的抗體蛋白。通過(guò)離心法純化膠體金抗體,選擇pa8

14、.20.01mol/L硼酸(0.5％BSA,0.5％PEG20000,15％蔗糖,0.05％Tween-20)作為金標(biāo)抗體緩沖液。
　　 3.快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的膠體金免疫層析法的建立
　　 (1)通過(guò)對(duì)試紙條檢測(cè)體系的優(yōu)化,通過(guò)定量分析,確定硝酸纖維素膜檢測(cè)線最佳包被抗體稀釋度為1:4,而質(zhì)控線為1:8；以1％牛血清白蛋白封閉1h,37℃(1h)烘干；浸泡有膠體金-抗體結(jié)合物的金標(biāo)墊,4℃抽干方法干燥；0.01mol/1

15、pH8.2硼酸,0.5％BSA,0.1％Tween-20,10％蔗糖處理樣品墊；硝酸纖維素膜,金標(biāo)墊,樣品墊及吸收紙組裝結(jié)合成試紙條。
　　 (2)構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫檢測(cè)試紙條,其檢測(cè)的靈敏度為2×106CFU/ml；特異性實(shí)驗(yàn)顯示本試紙條與溶血性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)菌、肺炎克雷氏菌、嗜麥菌窄食單胞菌、產(chǎn)氣桿菌、陰溝腸桿菌、奇異變形菌、大腸埃希菌、痢疾桿菌、副溶血弧菌共12株菌均無(wú)交叉反應(yīng)；穩(wěn)定性

16、檢測(cè)表明該試紙條可4℃保存4個(gè)月；本試紙條回收率為70.68％～106.87％。
　　 (3)通過(guò)生化鑒定方法獲得8株非創(chuàng)傷弧菌菌株,試紙條檢測(cè)結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致,未出現(xiàn)假陽(yáng)性。
　　 結(jié)論:本研究成功研制出創(chuàng)傷弧菌免疫層析試紙條。本試紙條插入溶液后,20min～30min內(nèi)可觀察結(jié)果。本試紙條的檢測(cè)靈敏度為2×106CFU/ml；與溶血性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)菌、肺炎克雷氏菌、嗜麥菌窄食單