結(jié)核分枝桿菌(Mtb)毒力因子Rv3033促進(jìn)Mtb在巨噬細(xì)胞中存活的機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)核?。═B）是長久以來困擾人們生活和工作的呼吸道傳播疾病。它是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病。1882年科赫發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌以來，迄今為止結(jié)核病的死亡人數(shù)已達(dá)數(shù)億人。結(jié)核分枝桿菌是一種需氧，無運(yùn)動(dòng)能力，生長緩慢，富含脂質(zhì)的抗酸性染色陽性的分枝桿菌。巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌的主要寄居細(xì)胞，也是機(jī)體抵抗結(jié)核分枝桿菌的主要場所。多年來，科學(xué)家們致力于結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞之間的功能研究，預(yù)期找到更為優(yōu)越的治療結(jié)核分枝桿菌的藥物靶點(diǎn)。細(xì)胞凋

2、亡在控制結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的生存及生長過程中具有重要作用，它不僅參與直接清除結(jié)核分枝桿菌的固有免疫，而且將凋亡小體提呈給T細(xì)胞，進(jìn)而通過適應(yīng)性免疫清除結(jié)核分枝桿菌。在這種相互依存又相互制約的環(huán)境下，結(jié)核分枝桿菌也產(chǎn)生多種抗衡手段，其中主要通過結(jié)核分枝桿菌自身的毒力蛋白發(fā)揮作用。Rv3033是結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)毒力因子，其大小約為19kDa，能夠促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的生存。但其在巨噬細(xì)胞中的作用尚未可知。因而深入了解與發(fā)現(xiàn)Rv30

3、33在巨噬細(xì)胞中的功能不但幫助我們揭示這一毒力蛋白的作用機(jī)理，同時(shí)也為我們找到新的藥物靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和前提。
　　本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建上調(diào)表達(dá)質(zhì)粒pMSCV–eGFP-Rv3033，包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒感染RAW264.7細(xì)胞，構(gòu)建上調(diào)表達(dá)Rv3033及Vector的巨噬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株（RAW-Rv3033及 RAW-Vector）。用 Mtb（BCG/H37Rv）感染RAW-Rv3033與 RAW-Vector，觀察 Rv30

4、33對(duì)于結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中存活的影響。CFU檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rv3033能夠促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的存活。BCG感染RAW-Rv3033及RAW-Vector12h后，通過高通量測(cè)序共發(fā)現(xiàn)464個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的差異基因有235個(gè)，下調(diào)表達(dá)的差異基因有229個(gè)。差異表達(dá)基因的功能主要涉及以下幾個(gè)過程：凋亡、自噬、細(xì)胞周期及炎癥等，以細(xì)胞凋亡為主。采用結(jié)核分枝桿菌減毒株BCG感染RAW-Rv3033與RAW-Vector

5、，觀察Rv3033對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響并做機(jī)制探討。結(jié)果顯示，上調(diào)Rv3033能夠抑制BCG感染引起的凋亡，并且這種凋亡的抑制現(xiàn)象是通過阻礙ER stress實(shí)現(xiàn)的。最后，原核表達(dá)純化Rv3033蛋白，與RAW264.7細(xì)胞裂解液共孵育后，pull down尋找與Rv3033相互作用的蛋白。質(zhì)譜分析后，篩選出8個(gè)可能與Rv3033相互作用的蛋白:Lrrfip1，Cofilin-1，Rhog，Rac2，HMGA1，Arhgap15，Arp