LPS對(duì)巨噬細(xì)胞氧依賴(lài)性殺傷結(jié)核分枝桿菌的促進(jìn)作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引起的，目前仍是發(fā)病率和病死率最高的傳染病之一。它被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病，伴有巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷結(jié)核菌過(guò)程貫穿其發(fā)生、發(fā)展的始終[1]。以往的研究表明[2]，機(jī)體感染 M.tb后，主要通過(guò)補(bǔ)體受體進(jìn)入巨噬細(xì)胞，并通過(guò)干擾巨噬細(xì)胞吞噬和溶酶體成熟而長(zhǎng)期寄生于宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)并造成潛伏感染。Toll樣受體（Toll-like recept

2、ors, TLRs）介導(dǎo)天然免疫，與抗 TB免疫反應(yīng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[3]， Toll樣受體4（Toll-like receptor4, TLR4）在巨噬細(xì)胞抗M.tb的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。有資料顯示[4]，非 M.tb來(lái)源的TLR4受體激動(dòng)劑 LPS可通過(guò) TLR4途徑和 NOX2 NADPH氧化酶及 ROS信號(hào)通路促進(jìn) THP-1巨噬細(xì)胞吞噬和殺傷 M.tb。探討 LPS促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬及殺傷 M.tb的機(jī)制，對(duì)于其作為免疫佐

3、劑或潛在的臨床抗結(jié)核預(yù)防用藥，具有重要價(jià)值。
　　目的：研究 LPS對(duì)巨噬細(xì)胞氧依賴(lài)性殺傷結(jié)核分枝桿菌的促進(jìn)作用，初步闡明其機(jī)制。
　　方法：（1）結(jié)核分枝桿菌減毒株 M.tb H37Ra用蘇通氏液體培養(yǎng)基于細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個(gè)月后接種至羅琴氏固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1個(gè)月，無(wú)菌接種環(huán)收集M.tb菌體于1 mL勻漿器中，加入生理鹽水反復(fù)研磨，取細(xì)菌懸液，用生理鹽水經(jīng)10000 rpm×2 min洗滌3次，抗酸染色陽(yáng)性且鏡下觀(guān)察

4、細(xì)菌分散。分光光度計(jì)檢測(cè)菌液濃度，用生理鹽水配成濃度為5×106/mL的M.tb懸液，4℃?zhèn)溆谩＃?）10-100μg/mL濃度異硫氰酸熒光素(FITC)，在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）中標(biāo)記 M.tb，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度（MFI）。FITC標(biāo)記的M.tb以10∶1的比例感染巨噬細(xì)胞THP-1(A)18 h-24 h，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析感染模型的感染率。
　?。?）取 FITC標(biāo)記的M.tb與佛波醇酯(PM

5、A)誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞(THP-1(A))共孵育1 h-6 h后，觀(guān)察PMA活化的THP-1(A)細(xì)胞吞噬 FITC標(biāo)記M.tb的時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化。
　?。?）0，100，1000 ng/mL不同濃度LPS刺激THP-1(A)細(xì)胞24 h后，與M.tb按不同比例（1:1-1:100）共培養(yǎng)30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS對(duì)THP-1(A)細(xì)胞吞噬 M.tb吞噬率的促進(jìn)作用。
　?。?）0，10，100，1000，1

6、0000 ng/mL不同濃度 LPS分別刺激 PMA分化前后的THP-1細(xì)胞24 h后，再與M.tb以1:50濃度比共孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS在THP-1細(xì)胞吞噬M.tb功能中的促進(jìn)作用。
　　（6）分別以抗人TLR4抗體HTA125阻斷TLR4，以DPI(diphenylene iodonium chloride)阻斷NOX2 NADPH氧化酶后，再以L(fǎng)PS（1000 ng/mL）作用THP-1(A)細(xì)胞24 h，

7、1:50濃度比例加入M.tb作用30 min，流式細(xì)胞術(shù)分析TLR4及NOX2 NADPH氧化酶信號(hào)途徑在LPS促進(jìn)THP-1(A)細(xì)胞吞噬M.tb中的作用。
　　（7）不同濃度熒光素二醋酸酯(FDA（0.1-1.0μg/mL）)，在磷酸鹽緩沖液（PBS， pH7.2）中標(biāo)記M.tb。取佛波醇酯(PMA)誘導(dǎo)分化的THP-1(A)細(xì)胞與FDA標(biāo)記M.tb于37℃孵育30 min，洗滌細(xì)胞，加入小牛血清，置37℃孵育0～60 min

8、后，三蒸水裂解細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)裂解細(xì)胞釋放的M.tb熒光強(qiáng)度變化，分析計(jì)算THP-1(A)細(xì)胞對(duì)吞噬M.tb的殺傷功能。同時(shí)觀(guān)察刺激劑LPS及阻斷劑HTA125和DPI對(duì)殺傷功能的影響。
　　（8）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS（100 ng/mL）對(duì)M.tb感染前后THP-1(A)細(xì)胞表面TLR4表達(dá)水平、胞內(nèi)ROS產(chǎn)量的促進(jìn)作用；Western blot檢測(cè)THP-1(A)細(xì)胞NOX2蛋白表達(dá)水平；熒光定量PCR檢測(cè)THP-1(A)

9、細(xì)胞胞內(nèi)TLR4mRNA，NOX2 mRNA基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:（1）100μg/mL的FITC濃度標(biāo)記M.tb的標(biāo)記率可達(dá)(99.02±0.74)％，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。
　?。?） PMA誘導(dǎo)分化的THP-1(A)細(xì)胞在4 h對(duì)M.tb-FITC的吞噬率未加臺(tái)盼藍(lán)淬滅組為(78.82±3.21)%與加臺(tái)盼藍(lán)淬滅組(68.88±0.46)%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。至6 h時(shí)吞噬率(93.65±1.47

10、)%達(dá)飽和。
　　（3）THP-1(A)與M.tb比例從1∶1增加至1∶100，其吞噬率從(2.17±0.15)%增加至(35.62±2.49)%。100 ng/mL的LPS在 THP-1(A)：M.tb-FITC達(dá)1:50時(shí)，吞噬率達(dá)(65.94±2.25)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　?。?）10 ng/mL濃度的LPS即可促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)M.tb的吞噬率，且隨濃度增加吞噬率逐漸增高，10000 ng/mL的L

11、PS濃度其吞噬率達(dá)(94.07±3.55)%較對(duì)照組(23.41±3.22)%增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　?。?）10μM DPI處理的巨噬細(xì)胞對(duì) M.tb的吞噬率降低至(75.93±1.06)%，20μM時(shí)降低更顯著，吞噬率達(dá)(58.16±0.98)%(P<0.05)。HTA125預(yù)處理的巨噬細(xì)胞吞噬M.tb吞噬百分率(38.57±1.35)%和LPS刺激組(83.25±2.53)%相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

12、0.05)。
　?。?）1.0μg/mL FDA對(duì) M.tb的標(biāo)記率可達(dá)(98.21±0.92)%，可滿(mǎn)足殺傷實(shí)驗(yàn)的需要。THP-1(A)細(xì)胞對(duì) M.tb0~60 min殺傷率隨時(shí)間增加而增加，60 min的殺傷率可達(dá)(54.16±2.17)%，與0 min殺傷率(15.21±0.63)%相比較，差異具有顯著性。
　?。?）100 ng/ mL LPS對(duì) THP-1(A)細(xì)胞30 min殺傷 M.tb的MFI值可達(dá)365.2

13、3±1.58與對(duì)照組608.35±2.16比較，差異有顯著性（P<0.01）。且隨濃度增加殺傷能力增強(qiáng)，10000 ng/mL的MFI值降低至216.59±4.21。
　?。?）HTA125及DPI預(yù)處理的THP-1(A)細(xì)胞對(duì)M.tb-FDA的殺傷能力降低至385.92±25.98和302.35±25.47，較LPS刺激組268.54±32.73，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　?。?）LPS可增強(qiáng)被 M.tb抑制的

14、巨噬細(xì)胞表面 TLR4受體的表達(dá)率。
　?。?0）Western blot結(jié)果顯示 LPS有助于上調(diào)被 M.tb抑制的THP-1(A)巨噬細(xì)胞 NOX2蛋白的表達(dá)量。
　?。?1）LPS可增強(qiáng)被 M.tb抑制的THP-1(A)細(xì)胞 ROS的產(chǎn)量。
　?。?2）熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激后，被 M.tb抑制的THP-1(A)胞內(nèi)的TLR4mRNA，NOX2mRNA基因表達(dá)量均明顯升高。