結(jié)核分枝桿菌HBHA影響巨噬細(xì)胞活化的功能研究.pdf

1、結(jié)核?。╰uberculosis,TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的單一病原菌造成人類死亡的重大疾病，據(jù)WHO2015年最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球新增感染結(jié)核病人高達(dá)1040萬人，其中，合并艾滋病毒（HIV）感染人數(shù)達(dá)到120萬人，中國、印度等發(fā)展中國家占新增病例的60％，僅2015年一年死于結(jié)核病的人數(shù)為140萬，其中40萬人死于結(jié)核病合并HIV感染，近十幾年來，由于艾滋病感染以及

2、免疫抑制劑廣泛使用，使得MTB耐藥率增加。因此，尋求一種有效預(yù)防MTB傳播的新型疫苗萬分迫切。
　　肝素結(jié)合血凝素（heparin-binding haemagglutinin,HBHA）是結(jié)核分枝桿菌重要的粘附蛋白，然而，關(guān)于HBHA在結(jié)核分枝桿菌中的毒力作用目前尚不明確。鑒于自噬在病原菌感染過程中發(fā)揮著十分重要的作用，本課題組利用Western blot、免疫熒光、siRNA和同源重組敲減BCG菌株中HBHA蛋白等技術(shù)，檢測H

3、BHA是否能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬， HBHA調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬過程中通過什么分子機(jī)制來輔助MTB逃離免疫殺傷，是本課題的重點(diǎn)研究內(nèi)容。
　　主要研究內(nèi)容分為以下三個(gè)部分：
　　第一部分、HBHA抑制巨噬細(xì)胞自噬
　　HBHA（8μg/mL）與巨噬細(xì)胞共同孵育2 hours，Western blot檢測LC3Ⅱ、Beclin-1、mTOR的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，HBHA能夠顯著抑制自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)，促

4、進(jìn)mTOR表達(dá)；為了更直觀的觀測LC3變化情況，我們還運(yùn)用免疫熒光檢測LC3，免疫熒光結(jié)果顯示LC3熒光顆粒顯著降低，表明HBHA能夠抑制LC3的生成；通過siRNA技術(shù)敲減Raw264.7細(xì)胞中NOD2和TLR4的表達(dá)水平，Western blot檢測LC3、P62變化情況，結(jié)果證明TLR4 siRNA組的細(xì)胞能夠有效阻斷HBHA抑制自噬這一過程，表明HBHA是通過調(diào)控TLR4的表達(dá)從而抑制巨噬細(xì)胞自噬；通過同源重組方法構(gòu)建BCG::

5、HBHA敲除株和BCG野生株感染Raw264.7巨噬細(xì)胞，免疫熒光觀察LC3變化情況，結(jié)果顯示，BCG::HBHA敲除株不能有效抑制LC3表達(dá)。
　　第二部分、HBHA通過活化Caspase家族誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡
　　流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞總凋亡率，流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，HBHA（10μg/mL）作用巨噬細(xì)胞24 hours/48 hours細(xì)胞總凋亡率顯著升高，為了驗(yàn)證是HBHA純化蛋白促進(jìn)的細(xì)

6、胞凋亡，而不是因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過長，培養(yǎng)液營養(yǎng)不足造成的細(xì)胞凋亡，我們運(yùn)用免疫熒光檢測HBHA純化蛋白何時(shí)進(jìn)入巨噬細(xì)胞，并且，能夠在細(xì)胞中存在多長時(shí)間不降解，結(jié)果顯示，HBHA（4μg/mL）2 hours就有少量進(jìn)入巨噬細(xì)胞，隨著時(shí)間延長，蛋白進(jìn)入細(xì)胞增多，并能穩(wěn)定表達(dá)至72 hours；Western blot檢測Caspase-8/Caspase-3活化程度，在HBHA作用24/48 hours均有活化的Caspase-3/Cas

7、pase-8條帶出現(xiàn)，加入Caspase家族的抑制劑z-VAD-fmk后，未見活化Caspase-3/Caspase-8條帶，表明HBHA是通過活化Caspase家族促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡；Western blot檢測凋亡抑制基因bcl-2的表達(dá)，HBHA作用24 hours后能夠顯著抑制bcl-2的表達(dá)。
　　第三部分、HBHA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化
　　1. HBHA純化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細(xì)胞72 h

8、ours，通過ELISA的方法對細(xì)胞上清細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，IL-10的表達(dá)水平升高，而TNF-α表達(dá)水平降低，初步推斷HBHA在低濃度、長時(shí)間誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，能夠?qū)aw264.7巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞；HBHA純化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細(xì)胞72 hours，分別通過Western blot、免疫熒光、流式細(xì)胞技術(shù)檢測ARG-1、CD206、iNOS表達(dá)水平，結(jié)果顯示，ARG-1和CD206表達(dá)均升

9、高，表明巨噬細(xì)胞成功誘導(dǎo)成M2型，加入HBHA（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細(xì)胞72 hours，結(jié)果顯示，ARG-1和CD206表達(dá)升高，證明HBHA低濃度長時(shí)間可將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞；HBHA純化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細(xì)胞72 hours檢測CUEDC2表達(dá)水平，并與未處理組巨噬細(xì)胞相比，HBHA（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細(xì)胞72 hours能夠促進(jìn)CUEDC2表達(dá)。