二色補(bǔ)血草鹽腺離子分泌特征及相關(guān)功能基因的研究.pdf

1、鹽腺是泌鹽鹽生植物中最重要的離子排出器官，這種結(jié)構(gòu)主要分布在植物的葉表面等地上部分器官，在調(diào)節(jié)體內(nèi)離子平衡、維持滲透壓穩(wěn)定及提高泌鹽鹽生植物的耐鹽性等方面發(fā)揮重要作用。目前，對(duì)植物鹽腺的泌鹽機(jī)理研究大多還停留在解剖學(xué)和生理學(xué)研究水平，鹽腺發(fā)育及泌鹽的分子機(jī)理研究相對(duì)滯后。如果能夠揭示植物鹽腺的發(fā)育和分泌的分子機(jī)制，克隆關(guān)鍵基因并最終培育具有泌鹽能力的作物，對(duì)于開(kāi)發(fā)利用鹽堿地具有重大意義。
　　二色補(bǔ)血草是一種典型的泌鹽鹽生植物，具

2、有多細(xì)胞鹽腺結(jié)構(gòu)，是研究雙子葉植物鹽腺的理想材料。因此，研究二色補(bǔ)血草鹽腺的泌鹽特征和分子機(jī)理具有重要意義。
　　本研究創(chuàng)建并優(yōu)化多種實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用于二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽機(jī)理的研究。首先，利用熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)，二色補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞團(tuán)的外壁層在330～380 nm的紫外光激發(fā)下具有獨(dú)特的自發(fā)熒光現(xiàn)象，可以作為研究鹽腺分布、形態(tài)及突變體篩選的簡(jiǎn)便、可靠手段；其次，本研究?jī)?yōu)化建立了一套不受外界干擾、利用一個(gè)葉片即可測(cè)定不同處理下鹽腺離子分泌的二

3、色補(bǔ)血草葉圓盤(pán)分泌模型，適用于二色補(bǔ)血草鹽腺分泌特征分析，葉圓盤(pán)的參數(shù)為：葉圓盤(pán)直徑12 mm，溶液離子濃度100～300 mmol L-1，分泌時(shí)間24 h，分泌溫度20～25℃，光照條件12 h光照+12 h黑暗（光照強(qiáng)度1000μmol m-2 s-1），溶液酸堿度pH=5～6.5；第三，本研究初步獲得了二色補(bǔ)血草鹽腺酶解分離方案：酶解液（0.1％果膠酶Y-23，1%崩潰酶，1%纖維素酶，pH=5.7），抽真空10分鐘，30℃黑暗

4、，30 rpm酶解，將酶解得到的大塊碎渣輕柔研磨，然后利用100μm、70μm和40μm濾器依次過(guò)濾，將鹽腺用20μm濾膜收集，為進(jìn)一步研究不同鹽腺細(xì)胞表達(dá)譜等奠定了基礎(chǔ)；第四，本研究成功的將由TRV病毒誘導(dǎo)的植物基因瞬時(shí)沉默技術(shù)（VIGS）移植到二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽研究中，篩選出最佳的條件為：8周齡幼苗，侵染農(nóng)桿菌濃度為OD600=0.8，侵染檢測(cè)期為侵染6天。
　　本研究利用離子色譜技術(shù)探索二色補(bǔ)血草葉片及鹽腺離子分泌特征，采用

5、不同鹽溶液處理，對(duì)二色補(bǔ)血草內(nèi)部和鹽腺分泌的離子進(jìn)行檢測(cè)，力求獲得二色補(bǔ)血草離子分泌的種類、選擇性和離子之間彼此作用的特征。結(jié)果表明，二色補(bǔ)血草鹽腺具有施加某種離子增強(qiáng)分泌某種離子的特點(diǎn)，分泌的陽(yáng)離子主要包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+和NH4+，分泌的陰離子主要包括Cl-、NO3-、SO42-、Br-、PO33-、NO2-、草酸根、甲酸根、乙酸根與檸檬酸根；二色補(bǔ)血草葉片內(nèi)部主要檢測(cè)出的陽(yáng)離子為Na+、K+、Ca2+、Mg2+以及

6、NH4+，陰離子為甲酸根、乙酸根、草酸根、檸檬酸根、SO42-、Cl-、NO3-和NO2-，二色補(bǔ)血草對(duì)一價(jià)堿土陽(yáng)離子和鹵素陰離子具有優(yōu)先吸收和外排能力；在不同鹽溶液處理下，二色補(bǔ)血草的Na+/K+維持在2.5以下，且K+沒(méi)有大量通過(guò)鹽腺分泌流失，說(shuō)明二色補(bǔ)血草的耐鹽機(jī)制主要是通過(guò)鹽腺把吸收的過(guò)多離子分泌到體外而不是區(qū)域化到液泡中；雖然二色補(bǔ)血草鹽腺具有施加某種離子增強(qiáng)分泌某種離子的特點(diǎn)，但其鹽腺的泌鹽作用具有顯著的離子選擇性：對(duì)陽(yáng)離子

7、分泌選擇性為Na+≥K+>Mg2+>Ca2+>NH4+，對(duì)陰離子分泌的選擇為 Cl-≥Br->SO42-=NO3-=NO2-=乙酸根>草酸根=甲酸根>檸檬酸根，并且二色補(bǔ)血草鹽腺分泌的總陰、陽(yáng)離子電荷基本是等量的；陰離子對(duì)二色補(bǔ)血草鹽腺Na+分泌的促進(jìn)作用為Cl-=Br->NO3-=SO42->檸檬酸根，陽(yáng)離子對(duì)二色補(bǔ)血草鹽腺Cl-分泌的促進(jìn)結(jié)果為Na+≥K+>Ca2+≥Mg2+，一價(jià)堿土陽(yáng)離子和鹵素陰離子在二色補(bǔ)血草鹽腺分泌中彼此促進(jìn)

8、；NaCl處理可以增加二色補(bǔ)血草葉片汁液中Ca2+濃度，Ca2+對(duì)二色補(bǔ)血草Na+分泌具有促進(jìn)作用，二價(jià)陰離子和有機(jī)酸根在鹽腺分泌中主要起到平衡電荷的作用。
　　目前對(duì)于植物激素和鹽腺分泌之間關(guān)系的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)40 mg L-1 GA3處理和60 mg L-1 ABA處理可以明顯的降低二色補(bǔ)血草Na+分泌速率，對(duì)于進(jìn)一步深入研究 GA3和 ABA在二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽過(guò)程的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　針對(duì)二色補(bǔ)血草鹽腺的

9、研究發(fā)現(xiàn)，二色補(bǔ)血草鹽腺分泌 Na+受到 Na+/K+ATPase、H+-ATPase、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SOS1）和Na+:K+:Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體（NKCC抑制劑）furosemide、vanadate、amiloride和 bumetanide的影響。因此我們推測(cè)編碼這些跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因可能參與二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽過(guò)程，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了可能與二色補(bǔ)血草泌鹽相關(guān)基因質(zhì)膜H+-ATPase、NKCC、SOS1和二色補(bǔ)血草

10、ENA同源片段的基因表達(dá)與鹽腺Na+分泌之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， H+-ATPase隨外源（0～300 mmol L-1）NaCl處理濃度的升高表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，與鹽腺Na+分泌速率呈現(xiàn)線性正相關(guān)關(guān)系(R2=0.99)，在40 mg L-1 GA3處理和60 mg L-1 ABA處理時(shí)表達(dá)量明顯降低，說(shuō)明H+-ATPase與激素處理導(dǎo)致Na+分泌速率降低相關(guān)；本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)NKCC定位于鹽腺，在200 mmol L-1 NaCl

11、處理下免疫組化信號(hào)增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)NKCC抑制劑bumetanide不僅抑制鹽腺Na+的外排也抑制K+的釋放，NKCC的表達(dá)量隨外源（0～300 mmol L-1）NaCl處理濃度的升高表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，與鹽腺 Na+分泌速率呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(R2=0.97)，在40 mg L-1 GA3處理和60 mg L-1 ABA處理中表達(dá)量明顯減低，與激素處理Na+分泌速率的變化趨勢(shì)相一致。SOS1的表達(dá)量隨外源（0～300 mmol L-1）NaC

12、l處理濃度的升高表達(dá)量有略微增加的趨勢(shì)，說(shuō)明SOS1在鹽腺分泌中起到一定作用，但是沒(méi)有H+-ATPase和NKCC那樣明顯，在40 mg L-1 GA3處理和60 mg L-1 ABA處理中SOS1并沒(méi)有體現(xiàn)出與Na+分泌速率相關(guān)的規(guī)律性變化，說(shuō)明SOS1的表達(dá)量并沒(méi)有通過(guò)這兩種激素的路徑調(diào)節(jié)；二色補(bǔ)血草ENA同源序列的表達(dá)量無(wú)論在NaCl處理還是激素處理中，表達(dá)量都呈現(xiàn)組成型特征。說(shuō)明NKCC和H+-ATPase是調(diào)控二色補(bǔ)血草Na+

13、分泌的關(guān)鍵基因，SOS1和 ENA可能參與了二色補(bǔ)血草的泌鹽過(guò)程，但不是調(diào)節(jié)Na+分泌的關(guān)鍵因子。
　　本實(shí)驗(yàn)成功地利用TRV介導(dǎo)的VIGS方案獲得了三組NKCC基因瞬時(shí)沉默的二色補(bǔ)血草葉片，其基因表達(dá)量為對(duì)照的60.3～75.1%，瞬時(shí)NKCC基因沉默的二色補(bǔ)血草葉片鹽腺的Na+分泌速率為空白對(duì)照的52%～67.5%，Cl-分泌速率為空白對(duì)照的59.1%～68.1%，下降趨勢(shì)明顯。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明NKCC是參與二色補(bǔ)血草鹽腺泌

14、鹽的關(guān)鍵基因。
　　以上結(jié)果說(shuō)明NKCC和H+-ATPase是調(diào)控二色補(bǔ)血草Na+分泌的關(guān)鍵基因， SOS1和ENA可能參與了二色補(bǔ)血草的泌鹽過(guò)程，但不是調(diào)節(jié)Na+分泌的關(guān)鍵因子。
　　為了獲取更多的二色補(bǔ)血草泌鹽相關(guān)基因以及探索泌鹽相關(guān)基因調(diào)控模式，本研究成功建立起二色補(bǔ)血草對(duì)照與200 mmol L-1NaCl處理下葉片數(shù)字基因差異表達(dá)譜，獲得了大量的信息。初步分析表明，200 mmol L-1NaCl處理下葉片許多抗性

15、響應(yīng)基因（如鹽和低溫響應(yīng)蛋白）表達(dá)都顯著升高，說(shuō)明這些基因可能參與了諸如泌鹽等耐鹽相關(guān)響應(yīng)。微管組成的基因α-Tubulin表達(dá)量也明顯升高，說(shuō)明了由α-Tubulin表達(dá)量增強(qiáng)帶動(dòng)植物體內(nèi)微管的變化可能與泌鹽活動(dòng)的囊泡化轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。此外我們還發(fā)現(xiàn)200 mmol L-1NaCl處理下二色補(bǔ)血草葉片糖類代謝基因和膜脂去飽和相關(guān)基因的表達(dá)都有升高，從另一方面可以驗(yàn)證二色補(bǔ)血草葉片鹽腺泌鹽活動(dòng)為耗能的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程及需要位于細(xì)胞膜系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)體參

16、與的觀點(diǎn)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　本論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：
　　1首次利用離子色譜技術(shù)對(duì)二色補(bǔ)血草的鹽腺的分泌物進(jìn)行定性和定量分析，發(fā)現(xiàn)二色補(bǔ)血草對(duì)一價(jià)堿土陽(yáng)離子和鹵素陰離子具有優(yōu)先吸收和外排能力且二色補(bǔ)血草鹽腺分泌的總陰、陽(yáng)離子電荷基本是等量的，并首次在植物鹽腺分泌物中檢測(cè)到甲酸根、乙酸根、檸檬酸根以及 NH4+，補(bǔ)充了對(duì)植物鹽腺分泌離子種類的認(rèn)識(shí)；
　　2首次驗(yàn)證了編碼質(zhì)膜Na+:

17、 K+: Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體和H+-ATPase的基因是調(diào)控二色補(bǔ)血草Na+分泌的關(guān)鍵基因，SOS1和ENA可能參與了二色補(bǔ)血草的泌鹽過(guò)程，但不是調(diào)節(jié)Na+分泌的關(guān)鍵因子；
　　3首次將基于病毒的植物瞬時(shí)基因沉默方案移植到二色補(bǔ)血草鹽腺研究中，并獲得 Na+: K+: Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體瞬時(shí)基因沉默植株，基因表達(dá)量為對(duì)照的60.3%～75.1%。Na+: K+: Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體基因瞬時(shí)沉默造成二色補(bǔ)血草鹽腺分泌Na+分泌速率降低為對(duì)照的5

18、2%～67.5%和Cl-降低為對(duì)照的59.1%～68.1%。表明VIGS是研究鹽腺泌鹽基因的良好工具；
　　4目前對(duì)于植物激素對(duì)植物鹽腺泌鹽的研究較少，本研究首次發(fā)現(xiàn)赤霉素和脫落酸對(duì)二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽及鹽腺發(fā)育具有影響，并驗(yàn)證赤霉素和脫落酸影響二色補(bǔ)血草的Na+分泌作用是通過(guò)影響H+-ATPase和Na+:K+:Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量而實(shí)現(xiàn)的；
　　5首次構(gòu)建二色補(bǔ)血草對(duì)照與200 mmol L-1NaCl處理下的數(shù)字基因差異