二色補血草幾丁質(zhì)酶基因chi31和chi32原核表達及重組酶分析.pdf

1、幾丁質(zhì)酶(chitinase Ec.3.2.14)是一種能降解幾丁質(zhì)及其衍生物的糖基水解酶,它能催化真菌細胞壁的重要成分——幾丁質(zhì)的水解,從而抑制真菌的生長增殖,提高植物的抗真菌能力,它廣泛存在于各種微生物、植物及動物細胞和組織中,參與多種生理過程。幾丁質(zhì)酶在生物防治和幾丁質(zhì)資源的利用等方面具有巨大的應用潛力,因而受到了廣泛的重視。
　　 二色補血草兩個幾丁質(zhì)酶基因chi31和chi32已被克隆并提交到GenBank(cDNA的

2、GenBank接受號分別為DQ431248和DQ431249)。本研究中利用實時定量RT-PCR技術研究了立枯絲核菌脅迫條件下,兩基因在二色補血草中的表達模式。結果表明,chi31,和chi32基因能夠應答真菌脅迫脅迫,兩個內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因對真菌病害的侵入均有防御反應。并且在同一組織中,兩基因在表達上存在時間上的先后;在不同組織中,同一基因的表達量也存在差距。這說明,這兩個基因可能在二色補血草中起到不同的作用,或分別隸屬于不同的生物學途

3、徑。
　　 利用表達型載體pET-52b(+)研究兩個幾丁質(zhì)酶基因的功能,分別構建原核胞內(nèi)表達載體pET-chi3lin和pET-chi32in。轉化大腸桿菌BL21,獲得轉化子BL21-chi3lin和BL21-chi32in。IPTG誘導培養(yǎng),通過對重組蛋白的SDS-PAGE檢測,得到了重組蛋白的陽性菌株。利用改良的Schales法對轉化子的酶活力進行測定,證實了重組酶CHI3lin和CHI32in的酶活性。并且對重組酶酶學

4、特性進行了分析:重組酶CHI3lin最適酶促反應條件為Mn2+5mmol/L,溫度40℃,pH值5.0。依照該體系以楊樹葉枯病細胞壁為底物測得的重組酶CHI3lin發(fā)酵液粗酶活能達到0.772U。重組酶CHI32in最佳反應體系Ba2+5mmol/L,溫度45℃,pH值5.0。依照該體系以楊樹爛皮病菌細胞壁為底物測得的重組酶CHI32in發(fā)酵液粗酶活能達到0.792U。
　　 進一步構建了原核胞外表達載體pET-chi3lex、

5、pET-chi32ex。重組酶CHI3lex最適酶促反應條件為Zn2+5mmol/L,溫度40℃,pH值5.0。依照該體系以楊樹葉枯病細胞壁為底物測得的重組酶CHI3lex發(fā)酵液粗酶活能達到0.921U。重組酶CHI32ex最適酶促反應體系K+5mmol/L,溫度45℃,pH值5.0。依照該體系以楊樹爛皮病細胞壁為底物測得的重組酶CHI32ex發(fā)酵液粗酶活能達到0.897U。
　　 在胞外原核表達中無論是在重組酶對真菌細胞壁的酶

6、活還是對化合物的酶活都普遍高于胞內(nèi)原核表達的重組酶的酶活。在胞內(nèi)原核表達中,重組酶CHI3lin對楊樹葉枯病細胞壁的酶活為0.499U,而在胞外原核表達中CHI3lex的酶活則高達0.921U。重組酶CHI32in對楊樹爛皮病細胞壁的酶活為0.702U,而在胞外原核表達中則高達0.897U。這個結果也間接證明了胞外原核表達中的重組酶具有降解病原真菌細胞壁的潛力,為CHI3lex和CHI32ex在生防方向的應用提供了依據(jù)。而胞內(nèi)原核表達中