中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中Enterolysin及Helveticin J基因多樣性及抑菌活性研究.pdf

1、隨著食品工業(yè)及食品國(guó)際貿(mào)易的日益擴(kuò)大,國(guó)內(nèi)外對(duì)食品安全問(wèn)題也越來(lái)越重視,如何防止食品腐敗變質(zhì)顯得極為重要,而目前市面上的防腐劑大多都是化學(xué)防腐劑,如果食用過(guò)量會(huì)對(duì)人體造成一定的損害,因此,像細(xì)菌素這類(lèi)無(wú)毒無(wú)害的生物防腐劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用顯得極具潛力。
　　乳酸菌細(xì)菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的一類(lèi)具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)。在低濃度下就能對(duì)有害菌產(chǎn)生不可逆地殺滅作用。它們可被人體生物降解和消化,對(duì)健康無(wú)害。大部分乳酸菌細(xì)菌素僅對(duì)親緣關(guān)系較近的菌株

2、產(chǎn)生抑制作用,只有少數(shù)具有較廣的抑菌譜。迄今為止,乳酸菌細(xì)菌素大致被分為三類(lèi):I類(lèi)細(xì)菌素是羊毛硫抗生素,是小的肽類(lèi),翻譯后修飾;II類(lèi)細(xì)菌素是未經(jīng)修飾的,熱穩(wěn)定的肽類(lèi);III類(lèi)乳酸菌細(xì)菌素是目前乳酸菌細(xì)菌素中研究較少的一類(lèi),這一類(lèi)細(xì)菌素屬于大分子的,熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì)菌素。目前,僅有五種III類(lèi)的乳酸菌細(xì)菌素被描述過(guò):Millericin, Enterolysin A(EnlA), Zoocin A, Lysostaphin and

3、Helveticin J(HlvJ)分別由Streptococcus milleri, Enterococcus faecalis, Streptococcuszooepidemicus4881, Staphylococcus aureus, and Lactobacillus helveticus產(chǎn)生,本研究主要研究的是Enterolysin A(EnlA)和Helveticin J(HlvJ)。Lactobacillus helve

4、ticus481產(chǎn)生的Helveticin J是染色體編碼的細(xì)菌素,具有較窄的抑菌譜,分子量37511Da,熱不穩(wěn)定,作用機(jī)制是殺菌;Enterolysin A是由Enterococcus faecalis LMG2333產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定的蛋白,具有較廣的抑菌譜,通過(guò)破壞敏感菌株的細(xì)胞壁來(lái)殺死細(xì)菌,根據(jù)已知文獻(xiàn)報(bào)道,Enterolysin可以抑制乳桿菌、腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌屬等等,極具研究潛力。
　　

5、中國(guó)有很多手工制作的傳統(tǒng)發(fā)酵食品,一些發(fā)酵食品中富含豐富的微生物菌群,因此,這些發(fā)酵食品中的微生物菌群可以為細(xì)菌素基因挖掘提供良好的平臺(tái),然而,迄今為止,這方面的研究還很少。在這次研究中,通過(guò)使用不依賴(lài)培養(yǎng)的宏基因組技術(shù)來(lái)研究六種中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的Enterolysin及Helveticin J的多樣性,并通過(guò)抑菌表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究它們的抑菌活性。
　　在本研究中,通過(guò)使用不依賴(lài)于培養(yǎng)的宏基因組方法對(duì)六種中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的Ente

6、rolysin和Helveticin J基因多樣性進(jìn)行研究,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索已知的Enterolysin和Helveticin J氨基酸序列,用clustal W對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),找到保守區(qū)域,用CODEHOP進(jìn)行引物設(shè)計(jì),通過(guò)PCR的方法在六種發(fā)酵食品樣品中擴(kuò)增Enterolysin和Helveticin J基因,PCR產(chǎn)物純化后連接到pGM-T載體上構(gòu)建成克隆文庫(kù)并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在4個(gè)克隆文庫(kù)中

7、　　(DFE,RSE,GCE,QCE)擴(kuò)增到Enterolysin基因(77-80aa),這些基因與NCBI中已知的氨基酸序列84％-96%相似,在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚集在同一個(gè)分支中;在5個(gè)克隆文庫(kù)中擴(kuò)增到Helveticin J基因(169-196aa),這些基因與NCBI中已知的氨基酸序列58%-100%相似?；谝呀?jīng)獲得的Enterolysin和Helveticin J基因部分片段,選擇2條Enterolysin基因序列和2條Helv

8、eticin J基因序列用基因步移的方法進(jìn)行全長(zhǎng)基因擴(kuò)增。獲得基因全長(zhǎng)后,連接到pET-28a表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。EnlA(DFE5)蛋白質(zhì)分子量大小30.6kDa,經(jīng)抑菌活性檢測(cè),能夠抑制3種指示菌,其中包括致病性的單增李斯特氏菌屬和金黃色葡萄球菌屬。HlvJ(RS9)編碼249個(gè)氨基酸,經(jīng)抑菌活性檢測(cè),僅對(duì)瑞士乳桿菌有抑菌作用;EnlA(GCE11)蛋白質(zhì)分子量大小25.3kDa,經(jīng)抑菌活性檢測(cè)后發(fā)