生物柴油基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、生物柴油具有可完全燃燒、再生降解等優(yōu)點(diǎn)，已受到許多國(guó)家的高度關(guān)注與重視。目前，生物柴油主要為由長(zhǎng)鏈脂肪酸與短鏈醇反應(yīng)生成的重質(zhì)型生物柴油，其生產(chǎn)原料主要來(lái)源于動(dòng)植物油脂，存在著與人爭(zhēng)糧的局面且價(jià)格較高，是制約生物柴油發(fā)展的重大因素。因此尋找廉價(jià)易得原料并利用非食用油脂合成輕質(zhì)生物柴油是未來(lái)的發(fā)展方向。隨著生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)基因工程手段控制已有微生物脂肪酸代謝途徑合成性能優(yōu)良的輕質(zhì)型生物柴油是生物柴油發(fā)展的趨勢(shì)。所以利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)

2、輕質(zhì)生物柴油具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本文主要研究工作如下:
　　 (1)大腸桿菌中調(diào)控脂肪酸代謝關(guān)鍵硫酯酶基因的研究，以大腸桿菌K-13的基因組為模板擴(kuò)增硫酯酶基因(tesA')，構(gòu)建該基因在大腸桿菌中的同源表達(dá)系統(tǒng)pETDuet-tesA'，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)。通過(guò)蛋白電泳在預(yù)測(cè)分子量21KDa處獲得極微量目的條帶，效果不是很明顯。
　　 (2)萼距花屬、月桂樹和香樟樹三種植物中調(diào)控脂肪酸代謝關(guān)鍵特

3、異性硫酯酶基因的研究，以經(jīng)密碼子優(yōu)化后化學(xué)合成的三種硫酯酶基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)不同引物和酶切位點(diǎn)PCR擴(kuò)增得到不同特異性的硫酯酶基因:chFatB，ucFatB，ccFatB。分別構(gòu)建了這三個(gè)基因在大腸桿菌中的異源表達(dá)系統(tǒng)pETDuet-chFatB，pETDuet-ucFatB，pETDuet-ccFatB，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)得到工程菌 pDchFatB，pDucFatB，pDccFatB。這三個(gè)表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)蛋白電泳在33KD

4、a處獲得了目的條帶，工程菌pDchFatB成功地使大腸桿菌生成172mg/L的脂肪酸，同空白對(duì)照菌190mg/L的產(chǎn)量相比，產(chǎn)量沒(méi)有提高，但在脂肪酸種類上生成了C8、C10的特異性中鏈脂肪酸;pDucFatB成功地使大腸桿菌生成473mg/L的脂肪酸，同空白對(duì)照菌相比，產(chǎn)量有明顯提高，是空白對(duì)照菌產(chǎn)量的2.5倍，且在脂肪酸的種類上，工程菌產(chǎn)生了中鏈的C10、C12、C14的脂肪酸;pDccFatB成功地使大腸桿菌生成234mg/L的脂肪

5、酸，同空白對(duì)照菌相比，產(chǎn)量有一定提高，比空白對(duì)照菌產(chǎn)量提高了23.2％，且在脂肪酸的種類上，工程菌產(chǎn)生了中鏈的C14的脂肪酸。
　　 (3)產(chǎn)輕質(zhì)生物柴油基因工程菌的構(gòu)建，以不動(dòng)桿菌ADP1基因組為模板擴(kuò)增得到高度非特異性的?；D(zhuǎn)移酶基因atfA，構(gòu)建該基因在大腸桿菌中不同的雙基因異源表達(dá)系統(tǒng)pETDuet-chFatB-atfA，pETDuet-ucFatB-atfA，pETDuet-ccFatB-atfA，并在大腸桿菌BL2

6、1中進(jìn)行表達(dá)得到工程菌pDchA，pDucA，pDccA。工程菌pDchA通過(guò)蛋白電泳在41KDa處只有極微量的目標(biāo)條帶，其余兩個(gè)工程菌pDucA和pDccA通過(guò)蛋白電泳在41KDa處有很明顯的目標(biāo)蛋白條帶。pDchA未能成功地使大腸桿菌生成中鏈脂肪酸乙酯;pDucA成功地使大腸桿菌生成7.6mg/L的脂肪酸乙酯，而空白對(duì)照菌中無(wú)脂肪酸乙酯的生成，且在脂肪酸乙酯的種類上，工程菌產(chǎn)生了中鏈的C12、C14的中鏈脂肪酸乙酯;pDccA成功地

7、使大腸桿菌生成6mg/L的脂肪酸乙酯，而空白對(duì)照菌中無(wú)脂肪酸乙酯的生成，且在脂肪酸乙酯的種類上，工程菌產(chǎn)生了中鏈的C14的中鏈脂肪酸乙酯。最后進(jìn)一步的分析表明pDucA和pDccA工程菌胞內(nèi)仍存在8.5mg/L與8.7mg/L的脂肪酸未在?；D(zhuǎn)移酶的作用下與乙醇反應(yīng)生成相應(yīng)的脂肪酸乙酯。所以后續(xù)優(yōu)化乙醇流加量(1％-5％)，最終得出最佳的乙醇流加量為3％。
　　 (4)產(chǎn)乙醇基因工程菌的構(gòu)建，以克雷伯氏菌基因組為模板擴(kuò)增得到丙酮

8、酸脫羧酶(PDC1)和乙醇脫氫酶(AdhE)，構(gòu)建這兩個(gè)基因在大腸桿菌中單基因與雙基因表達(dá)系統(tǒng)pETDuet-PDC1、pETDuet-PDC1-AdhE，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。單基因表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)蛋白電泳在61KDa處有明顯的目標(biāo)條帶，雙基因表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)蛋白電泳在96KDa處有很明顯的目標(biāo)蛋白條帶。發(fā)酵培養(yǎng)顯示單基因工程菌中乙醇產(chǎn)量為88mg/L，同空白對(duì)照菌株的產(chǎn)量75mg/L，提高幅度較小。雙基因工程菌最終發(fā)酵液中乙醇產(chǎn)量