代謝工程改造的鏈霉菌生物合成去甲基C-1027和iso-Migrastatin的研究.pdf

1、本文對(duì)兩種代謝工程改造的鏈霉菌生產(chǎn)兩種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。
　　 C-1027是Streptomyces globisporus產(chǎn)生的一種新型的大分子蛋白類抗腫瘤化合物，屬于烯二炔類抗腫瘤抗生素。采用遺傳操作技術(shù)使C-1027產(chǎn)生菌S.globisporus中的sgcD4基因失活得到sgcD4基因阻斷的突變株SB1052，可以生產(chǎn)新型C-1027衍生物——去甲基C-1027;而C-1027的生產(chǎn)可以通過sgcD4

2、基因額外補(bǔ)全恢復(fù)。這些結(jié)果不但進(jìn)一步確認(rèn)了sgcD4基因確實(shí)編碼一個(gè)O-甲基轉(zhuǎn)移酶，而且明確突出了通過合理性設(shè)計(jì)發(fā)展結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物（如烯二炔類化合物）結(jié)構(gòu)多樣性的優(yōu)勢(shì)。然后通過系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)來提高去甲基C-1027這種新型抗生素的發(fā)酵產(chǎn)量。首先建立了方便易行的生物檢測(cè)去甲基C-1027的方法；經(jīng)過優(yōu)化，最終得到了一個(gè)去甲基C-1027發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)良配方，去甲基C-1027的產(chǎn)量在搖瓶發(fā)酵和10L發(fā)酵罐上批次發(fā)酵達(dá)到95mg/L左右，

3、提高到優(yōu)化前的7倍，并達(dá)到了野生菌產(chǎn)C-1027(50～100mg/L)的水平。以上研究說明，將現(xiàn)代組合生物合成的方法和傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化相結(jié)合、以提高工程菌中新型代謝物的效價(jià)是一個(gè)非常有效的策略。這為擴(kuò)大天然產(chǎn)物庫以便于新藥發(fā)展提供了一個(gè)新的有效手段。
　　 iso-Migrastatin(iso-MGS)是由Streptomyces platensis NRRL18993生產(chǎn)的一種戊二酰亞胺類抗生素，是一種非常優(yōu)良的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

4、的化合物。iso-MGS的生物合成基因簇已經(jīng)被成功克隆，并且iso-MGS已經(jīng)在5種鏈霉菌宿主中成功得到異源生物合成。然而，相對(duì)于野生菌，iso-MGS的異源生物合成產(chǎn)量非常低。
　　 本文對(duì)五個(gè)異源工程菌的iso-MGS發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行全面系統(tǒng)研究。首先對(duì)五個(gè)異源工程菌在三種培養(yǎng)基中的發(fā)酵進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示，工程菌SB11001和SB11002更適合支持iso-MGS的發(fā)酵生產(chǎn)，R2YE發(fā)酵培養(yǎng)基適合支持iso-MGS的發(fā)酵生

5、產(chǎn)。然后對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果為種子培養(yǎng)基選用R2YE培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間72h，接種量8％(v/v)，發(fā)酵培養(yǎng)收獲時(shí)間為5天，發(fā)酵液初始pH值6.5。在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，所有五個(gè)異源工程菌的生產(chǎn)效價(jià)得到了大大提高，分別提高了3～18倍，SB11001最高產(chǎn)量達(dá)128.6mg/L。設(shè)計(jì)了兩種R2YE與B2的混合培養(yǎng)基，來同時(shí)達(dá)到iso-MGS高產(chǎn)和產(chǎn)物單一的目的，通過探索，SB11001的iso-MGS發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到18

6、6.7mg/L。此外，為了驗(yàn)證碳酸氫鹽和iso-MGS發(fā)酵生產(chǎn)效價(jià)之間的的關(guān)系，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的碳酸氫鈉，結(jié)果當(dāng)NaHCO3添加濃度為2g/L時(shí)，iso-MGS發(fā)酵產(chǎn)量提高到了213.8mg/L。
　　 利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，將其應(yīng)用于檢測(cè)異源工程菌S.albus SB11001的iso-MGS的11個(gè)生物合成基因（mgsA-mgsK)的mRNA在四種不同培養(yǎng)基下轉(zhuǎn)錄水平的差異。建立了一套行之有效的鏈霉菌實(shí)