問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體屬特異性外膜蛋白LipL41抗原表位預(yù)測(cè)及其有效表位噬菌體展示肽的篩選.pdf

1、背景和目的：鉤端螺旋體(Leptospirosis)(簡(jiǎn)稱鉤體)病是由問(wèn)號(hào)鉤體(Leptospira interrogans)感染引起的自然疫源性人獸共患傳染病,世界范圍內(nèi)廣泛流行,尤其多見(jiàn)于水稻種植區(qū),我國(guó)也是該病流行的主要疫區(qū)之一。問(wèn)號(hào)鉤體自然宿主眾多,多可在其腎臟長(zhǎng)期生存繁殖,并可隨尿液排出,污染土壤和水源,人類?？赏ㄟ^(guò)接觸疫土和疫水而感染,因而鉤體病也是各國(guó)洪澇災(zāi)害時(shí)重點(diǎn)防疫和監(jiān)控的傳染病之一。接種疫苗是預(yù)防和控制鉤體病的最有效

2、措施,但鉤體血清群、型眾多,各血清群、型抗體之間交叉保護(hù)作用較弱或無(wú)。不同國(guó)家甚至同一國(guó)家不同地區(qū)主要流行的問(wèn)號(hào)鉤體血清群、型差異很大,常隨當(dāng)?shù)刈匀凰拗髯兏淖?給鉤體病預(yù)防帶來(lái)很大困難。目前普遍使用的鉤體疫苗是根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍械臄?shù)種優(yōu)勢(shì)鉤體血清群、型制備的多價(jià)鉤體全菌死疫苗,交叉保護(hù)作用弱且副作用較大。多價(jià)鉤體外膜疫苗是由我國(guó)科學(xué)家首先研制成功的組分疫苗,雖顯示免疫效果好和副作用小等優(yōu)點(diǎn),但交叉保護(hù)作用較差的缺陷仍未得到改變。位于鉤體外

3、膜上的外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)在決定抗原特異性方面有重要作用,其中一些蛋白為鉤體屬特異性抗原,例如LipL41,它們的編碼基因幾乎保守的存在于所有致病鉤體中,在問(wèn)號(hào)鉤體基因工程疫苗的研制上有廣泛的前景。外膜脂蛋白LipL41由355個(gè)氨基酸組成,在鉤體的內(nèi)外兩層膜中都有分布,并暴露于外膜表面。Haake等(2000)克隆出lipL41全長(zhǎng)基因序列,并發(fā)現(xiàn)它只存在于致病鉤體中,而在非致病鉤體中則

4、測(cè)不到。我們以往的研究結(jié)果也證實(shí)我國(guó)15群15型問(wèn)號(hào)鉤體標(biāo)準(zhǔn)參考株均有l(wèi)ipL41基因,但存在兩個(gè)不同的基因型lipL41/1和lipL41/2,其中l(wèi)ipL41/1基因型包含了我國(guó)人群中流行最廣的問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群、波摩那群、流感傷寒群、秋季群和賽羅群等,而lipL41/2基因型所包含的鉤體血清群在國(guó)內(nèi)的發(fā)病率都較低。此外研究還發(fā)現(xiàn)多數(shù)問(wèn)號(hào)鉤體臨床分離株都含有ipL41基因,并且表達(dá)LipL41蛋白,在多數(shù)鉤體病人的血清中也可測(cè)到相應(yīng)

5、保護(hù)性抗體的存在。含多個(gè)和多種抗原表位(epitope)的多抗原肽(multiple antigenicpeptide,MAP)是近年發(fā)展起來(lái)的一種研制新型基因工程疫苗的先進(jìn)技術(shù)和研究策略,是解決普通鉤體疫苗交叉保護(hù)作用弱的有效途徑,而鑒定有效的抗原表位是研制MAP的第一步。研究抗原表位不僅可深層次的揭示蛋白抗原分子誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子機(jī)制及特點(diǎn),而且在研制新型分子疫苗方面也有重要應(yīng)用前景。通過(guò)噬菌體展示系統(tǒng)對(duì)LipL41/1和LipL4

6、1/2的T和B有效聯(lián)合表位進(jìn)行鑒定,可為進(jìn)一步研制鉤體MAP疫苗奠定基礎(chǔ);序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因型存在少量氨基酸序列差異,且某些殘基的差異使兩個(gè)基因型的某些預(yù)測(cè)表位產(chǎn)生了較為顯著的差異,對(duì)這些有差異的表位進(jìn)行鑒定有利于深入了解其抗原性和免疫反應(yīng)性特點(diǎn)及個(gè)別氨基酸序列突變對(duì)其表位抗原性的影響,同時(shí)也可為下一步評(píng)估MAP疫苗的保護(hù)范圍提供參考。
　　實(shí)驗(yàn)方法：采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)LipL41/1和LipL41/2的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位進(jìn)行

7、預(yù)測(cè)和分析。選擇主要T細(xì)胞和B細(xì)胞聯(lián)合表位肽并融合表達(dá)于M13KE噬菌體PⅢ蛋白上,PEG/NaCl沉淀法提純重組噬菌體,SDS-PAGE鑒定目的重組PⅢ蛋白(rPⅢ)。分別以自制備rLipL41/1、rLipL41/2、黃疸出血群賴型賴株血清和病人抗血清為一抗,采用Western blot對(duì)上述表位肽進(jìn)行鑒定和篩選。
　　結(jié)果：通過(guò)抗原表位預(yù)測(cè),選擇了6個(gè)LipL41/1和2個(gè)LipL41/2聯(lián)合表位。經(jīng)擴(kuò)增獲得了預(yù)期的各抗原表

8、位片段。各目的表位序列均準(zhǔn)確插入噬菌體PⅢ蛋白N端并有效表達(dá)。各抗血清均能識(shí)別上述8個(gè)聯(lián)合表位,但雜交信號(hào)強(qiáng)度存在差異,表現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是用同一抗血清為一抗時(shí),不同表位的雜交信號(hào)強(qiáng)度不同,另一方面是同一表位對(duì)不同抗血清的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度也存在差異。表位中或附近的氨基酸序列突變可能會(huì)對(duì)表位的抗原性產(chǎn)生一定的影響,既可以使突變后表位與原抗體的親和力升高也可表現(xiàn)為降低。綜合8個(gè)表位對(duì)不同抗血清的Western Blot結(jié)果及實(shí)際意義,表位Lip