噬菌體展示技術在GP Ⅱb-Ⅲa抗原表位篩選中的應用.pdf

1、在該研究中,我們以GP Ⅱb／Ⅲa鼠單抗H7為隨機噬菌體十二肽庫的篩選靶標.H7單抗有很好的抑制血小板聚集的活性.從篩選出的結合肽,能分析可能的抗原表位,探討結合肽作為血小板自身抗體拮抗劑的可能性.這將為以后對GP Ⅱb／Ⅲa結構和功能研究,GP Ⅱb／Ⅲa及其配基之間的相互作用以及研制血小板自身抗體拮抗劑提供一定幫助.抗血小板GP Ⅱb／Ⅲa鼠單抗H7 IgG由該所分子免疫研究室制備.我們采用噬菌體隨機十二肽庫篩選H7單抗的特異性肽配

2、基,用P／N比值評價特異性結合的噬菌體克隆的富集效果.經(jīng)過4輪的生物淘洗,P／N比值提高到約40倍,說明特異性結合的噬菌體克隆得到富集.從第4輪篩選結果中隨機挑選25個陽性克隆進行擴增和提取噬菌體單鏈DNA,然后測定核苷酸序列,共獲得6種序列.在間接ELISA實驗中,設立無關噬菌體組作為非特異性吸附的對照組.用我們篩選到的6種序列噬菌體克隆,和H7單抗靶蛋白結合,隨后對噬菌體進行顯色,測定反映結合力的OD值.間接ELISA實驗證明這6種

3、噬菌體克隆都和靶蛋白特異性結合.隨后我們進行了血小板膜蛋白的粗提純,用于噬菌體結合肽的競爭ELISA實驗.經(jīng)ELISA鑒定,證明我們獲得的血小板膜蛋白具有很好抗原抗體結合活性.綜合結合肽序列、ELISA、功能分析試驗和計算機分析結果,我們認為Ⅱb／Ⅲa蛋白上的2個位點Ⅱb：900-902aa（PSR）和Ⅲa：495-498aa（RPS）可能就是H7單抗作用的抗原表位所在區(qū)域,并且可能也是Ⅱb／Ⅲa蛋白的功能部位,這些還需今后進一步研究證