采用噬菌體肽庫篩選Rh(D)血型抗原模擬表位及其鑒定.pdf

1、目的:用人源純化的混合抗Rh(D)多克隆抗體篩選噬菌體肽庫,從中尋找到Rh(D)血型抗原的模擬表位,為研制針對Rh(D)血型不合新生兒溶血病(RhD-Hemolytic disease of newborn,RhD-HDN)的新型診斷抗原、制備特異疫苗以及探索新的治療方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:1.收集5例經(jīng)不規(guī)則抗體篩查為陽性并鑒定含抗Rh(D)抗體的Rh(D)陰性者血清,經(jīng)等比例混合后,分別用RhD(-)A型、RhD(-)B

2、型壓積紅細(xì)胞對血清中的抗A、抗B抗體于4℃過夜吸收處理;滲透濃度為30mmol/L的PB作為裂解液,將遺傳表現(xiàn)型為CCDee的RhD陽性O(shè)型紅細(xì)胞制備成血影細(xì)胞,觀察其抗原性;以血影細(xì)胞作為抗原,吸附血清中抗Rh(D)抗體,再用低pH值緩沖液洗脫、分離純化抗Rh(D)抗體,用DEAE-Sephadex A-50層析法提取其中免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)組分;用western blot鑒定條帶成分,微柱法測抗R

3、h(D)抗體效價(jià)。
　　2.用純化的多克隆抗Rh(D)抗體對噬菌體隨機(jī)十二肽庫進(jìn)行三輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過程篩選,計(jì)算每輪的富集率;酶聯(lián)免疫吸附(EnzymeLinked Immunosorbent Assay,ELISA)法檢測每輪篩選后洗脫物與抗Rh(D)抗體的結(jié)合情況;ELISA法檢測隨機(jī)挑取的第三輪篩選后滴度測定平板上的26個(gè)噬菌體克隆與抗Rh(D)抗體結(jié)合情況;對ELISA法檢測中A450值高于0.5的16個(gè)噬菌體克隆

4、進(jìn)行陽性噬菌體克隆的初篩實(shí)驗(yàn),逐一檢測每個(gè)噬菌體克隆與抗體的結(jié)合力;提取陽性克隆DNA并進(jìn)行測序,推導(dǎo)外源多肽的氨基酸序列。凝集抑制實(shí)驗(yàn)檢測噬菌體展示的多肽對Rh(D)血型抗原結(jié)合的模擬作用。
　　結(jié)果:
　　1.5例血清中均含抗Rh(D)抗體,微柱法檢測混合血清抗Rh(D)抗體效價(jià)為32;混合血清中的抗A和抗B血型抗體被完全吸收,吸收后血清中的抗A和抗B效價(jià)均<2;制備的血影細(xì)胞保持了較強(qiáng)的抗原性;純化后抗Rh(D)抗體I

5、gG組分效價(jià)達(dá)到32。
　　2.三輪篩選后,富集率從(4.45×10-6)％增加到(4.27×10-5)%;隨著篩選輪數(shù)增加,噬菌體洗脫物與抗Rh(D)抗體的結(jié)合力逐漸增強(qiáng);第三輪篩選后26個(gè)噬菌體克隆與抗Rh(D)抗體具有不同的結(jié)合力,其中2,8,12,17,21,22克隆與抗Rh(D)抗體呈高親和力結(jié)合;初篩實(shí)驗(yàn)中洗脫的噬菌體滴度測定顯示克隆2,8,12,17,21,22在與抗體結(jié)合后的洗脫物中含量較高,并且與牛血清白蛋白(B

6、SA)反應(yīng)結(jié)合后的洗脫物中含量很低;上述6個(gè)陽性克隆中4個(gè)噬菌體克隆DNA序列一致:5’-CCGAGCCAGGGGTACGTGATACTGCTGGACGAGAAG-3’,展示相同的氨基酸序列(PSQGYVILLDEK),命名為C2;另外2個(gè)噬菌體克隆DNA序列一致:5'-ACAATGTTAAATCGTGCTCATGATTTTTCTGAATGT-3',展示相同的氨基酸序列(TMLNRAHDFSEC),命名為C21。凝集抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明展示