梅毒螺旋體特異性診斷抗原的篩選、制備及臨床應(yīng)用初探.pdf

1、目的： 梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum subsp.pallidum,TP)引起的一種危害性極大的全世界流行的性傳播疾病(STD)。采用基因工程抗原建立的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)實(shí)驗(yàn)以其快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)在臨床梅毒檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用，但是，目前的檢測(cè)方法仍然存在靈敏性差、假陽(yáng)性率高、早期梅毒感染的檢出能力較差等缺點(diǎn)，急需尋找新的特異性和靈敏度更高的抗原來(lái)提高梅毒早期檢出率。本研究旨在通過(guò)生物

2、信息學(xué)及基因工程技術(shù)篩選、制備梅毒螺旋體多種重組外膜蛋白抗原，探討其在梅毒血清診斷中的價(jià)值，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)臨床檢測(cè)效果更好的新型梅毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法 1．通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，篩選出具有良好診斷潛力的梅毒螺旋體特異性外膜抗原。再用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)上述抗原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原決定簇分布情況，分別選定各個(gè)抗原中抗原決定簇豐富、抗原性高、特異性高的區(qū)域。 2．根據(jù)篩選的基因(TP17、TP0

3、453、TP0684)，用分子克隆的方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-TP17、pET-28a(+)-TP0453、pET22b(+)-TP0684，轉(zhuǎn)化工程菌大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，用親和層析、離子交換、凝膠過(guò)濾層析等多種方法聯(lián)合純化，獲得純度較高的目的蛋白。 3．將純化后的TPN17、TP0453、TP0684蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至NC膜，分別以梅毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗，進(jìn)行

4、重組蛋白的免疫印跡分析。 4．以上述純化蛋白為抗原，單獨(dú)或聯(lián)合包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，建立間接ELISA方法檢測(cè)梅毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血清。摸索最適抗原包被組合和包被濃度、最適抗原吸附方式、最適封閉液和封閉時(shí)間、最適血清反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度、最適二抗工作濃度、最適顯色液等條件。 5．用已優(yōu)化的ELIsA檢測(cè)體系對(duì)各期梅毒病人、正常人、易發(fā)生交叉反應(yīng)人群、國(guó)家質(zhì)控參比血清進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。 結(jié)果 1．通過(guò)生物

5、信息學(xué)分析和文獻(xiàn)調(diào)研，選擇TP17、TP0453、TP0684三個(gè)梅毒特異性外膜蛋白作為候選診斷抗原，并預(yù)測(cè)出各個(gè)蛋白抗原決定簇較豐富、抗原性較強(qiáng)、特異性高的區(qū)域，分別是：TPN17(22～156aa)、TP0453(29～287aa)、TP0684(30～434aa)。 2．成功構(gòu)建了能夠高效表達(dá)TP17、TP0453、TP0683優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域的重組表達(dá)質(zhì)粒：pET22b(+)-TP17、pET28a(+)-TP0453、pE

6、T22b(+)-TP0684。序列分析與Genbank公布的相應(yīng)序列完全一致。 3．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，獲得重組工程菌后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)的目的蛋白TP17、TP0453、TP0684分子量約為18kDa、29kDa、43kDa。UVP掃描證實(shí)目的蛋白的表達(dá)分別約占總蛋白的18％、24％和32％。對(duì)表達(dá)形式進(jìn)行鑒定：TP17為可溶形式表達(dá)；TP0453、TP0684為包涵體形式表達(dá)。 4．用

7、親和層析、離子交換、凝膠過(guò)濾層析等方法聯(lián)合對(duì)TPN17蛋白進(jìn)行純化，獲得的蛋白純度>95％；用親和層析方法對(duì)TP0453蛋白進(jìn)行純化，獲得的蛋白純度>90％；用親和層析方法對(duì)TP0684蛋白進(jìn)行純化，獲得的蛋白純度>85％。 5．免疫印跡結(jié)果顯示重組蛋白TP17、TP0453、TP0684與梅毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清有良好的免疫反應(yīng)性，而與梅毒陰性血清不發(fā)生反應(yīng)。 6．采用不同抗原組合，建立并優(yōu)化ELISA方法，檢測(cè)梅毒病人血清，

8、發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的靈敏度和特異性受抗原種類和組合比例的影響，抗原聯(lián)合使用比單個(gè)抗原效果好，其中最適的抗原組合為TP17和TP0453抗原，而TP0684抗原在ELISA檢測(cè)中效果不好；最適包被濃度為TP17(0.5μg/ml)+TP0453(μg/ml)；抗原最適吸附方式為37℃孵育4h轉(zhuǎn)4℃過(guò)夜；最適封閉條件為1％BSA 37℃封閉2h轉(zhuǎn)4℃過(guò)夜；最適血清反應(yīng)條件為37℃溫育45min；酶標(biāo)二抗1：15000稀釋；以TMB為最適顯色液底物。

9、 7．經(jīng)各種標(biāo)本檢測(cè)和方法學(xué)評(píng)價(jià)，以TP17和TP0453組合抗原為診斷抗原建立的間接ELISA方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清盤的檢測(cè)靈敏度為94.4％，特異性為97.1％，符合率95.7％，最低檢出限為0.25NCU/ml；與非梅毒血清沒(méi)有交叉反應(yīng)性；與TPPA方法一致性好，特異性高于市場(chǎng)上已有國(guó)產(chǎn)ELISA檢測(cè)試劑盒。 結(jié)論 1．預(yù)測(cè)出了梅毒螺旋體TP17、TP0453、TP0684三個(gè)特異性抗原基因中抗原表位豐富的區(qū)段。

10、 2．高效表達(dá)了TP17、TP0453、TP0684三種蛋白，并采用親和層析、離子交換、凝膠過(guò)濾層析等多種方法分別對(duì)其進(jìn)行了純化。 3．建立并優(yōu)化了應(yīng)用TP17、TP0453蛋白作為診斷抗原檢測(cè)血清中梅毒特異性抗體的ELISA方法。本方法在初步應(yīng)用中顯示了較高的特異性和靈敏度，與金標(biāo)準(zhǔn)TPPA方法有優(yōu)良的一致性，為研發(fā)新型梅毒診斷試劑盒奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。 4．TP0684在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中顯示了良好的免疫反應(yīng)性，提