DLC2生理學特性及其與血管生成相關性的研究.pdf

1、研究背景：黏著斑(focal adhesion)是一個以整合素(integrin)為中心的蛋白分子復合體，整合素的胞內段與肌動蛋白細胞骨架(微絲)接合，胞外段與細胞外基質(extracellular matrix,ECM)結合，從而實現(xiàn)細胞和細胞外基質的相互黏附，并參與信號胞內轉導，調節(jié)細胞遷移、增殖、分化、死亡和基因表達。整合素胞內段與肌動蛋白(actin)的接合必需借助于一系列蛋白，這些蛋白被稱為黏著斑相關蛋白。DLC(Delete

2、d in liver cancer)蛋白亞家族即屬于黏著斑相關蛋白。DLC目前有三個成員：DLC1、DLC2和DLC3，它們具有相似的蛋白結構：由SAM功能域、RhoGAP功能域和START功能域組成。DLC含有RhoGAP功能域，因而也屬于Rho GTP酶激活蛋白家族(Rho GAPs)，這些蛋白的主要功能與其RhoGTP酶蛋白(RhoGAP)活性有關。DLC1是DLC第一個成員，對它的研究也最全面。DLC1是在對肝癌染色體缺失片段的

3、研究中被發(fā)現(xiàn)并克隆的。DLC1被認為屬于抑癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。DLC1參與調節(jié)細胞形態(tài)、黏附、遷移、增殖和死亡。在DLC1缺失的細胞中重表達DLC1可有效的抑制細胞生長。DLC1基因敲除小鼠胚胎在10.5dpe(dayspost coitum)后不能存活。DLC2，別名STARD13，于2003年被成功克隆，它與DLC1有相似的蛋白結構，也在多種腫瘤中表達下調，亦可通過其RhoGAP結構域抑制腫瘤細胞的生長，因而也被認為

4、是一個潛在的抑癌基因。但是，DLC2在功能上是否與DLC1有不同，是否是一個冗余基因，我們尚無答案。目前對于DLC2的研究尚處起步階段，尚未建立DLC2表達譜，對DLC2的潛在抑癌作用機制和其它生理學功能的了解也非常貧乏。
　　 研究內容：在本研究中，我們擬對DLC2的基本生物學特征進行較全面的研究，包括建立DLC2基因敲除小鼠模型；借助基因報告-敲除系統(tǒng)，描繪小鼠體內DLC2的表達譜，同時研究DLC2基因缺失后對小鼠體內血管生

5、成等的影響。此外，我們還要在上述研究結果的基礎上進一步研究DLC2在內皮細胞中的功能以及它與血管生成之間的關系，并探討了DLC2調控血管生成的機制，為明確DLC2的生理學功能和抑癌作用機制，以及將DLC2應用于抗腫瘤治療的靶點奠定了理論基礎。
　　 本研究分為四個部分：
　　 第一章 DLC2基因結構、序列特征和表達特點。
　　 目的：了解DLC2的基本生物學特征和表達情況。
　　 方法：⑴通過生物信息學

6、方法分析DLC2基因結構和分子序列的特征；⑵采用實時定量PCR在mRNA水平檢測小鼠各個組織器官中DLC2的表達情況；⑶采用實時定量PCR在mRNA水平檢測人惡性腫瘤eDNA樣本(腎癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、卵巢癌、胃癌和食管癌)中DLC2的表達情況；⑷制備特異性抗DLC2抗體，在蛋白水平檢測結腸癌、乳腺癌和前列腺癌細胞系中DLC2的表達情況；⑸構建GFP-DLC2融合蛋白，研究DLC2的亞細胞定位。
　　 結果及結論

7、：①DLC2屬于Rho GTPase-activating proteins(GAPs)家族成員，它的蛋白分子結構中包括SAM、RhoGAP和START三個結構域，DLC2的生理學功能可能與RhoGAP結構域活性密切相關；②DLC2在小鼠肺組織中有較高轉錄水平，在脾和骨骼肌中無表達；③DLC2在人乳腺癌和前列腺癌中表達下調，提示DLC2可能作為抑癌基因參與乳腺癌和前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程；④DLC2通過N'端定位于黏著斑，包括SAM結構

8、域、FAT結構序列，但具體負責結合的部位和酪氨酸位點尚需進一步研究。
　　 第二章 DLC2基因敲除小鼠模型的建立和DLC2組織分布特點。
　　 目的：建立DLC2基因敲除小鼠模型，觀察DLC2缺失表型及DLC2表達特征，從中推測DLC2的生理學功能。
　　 方法：⑴在小鼠胚胎干細胞中通過同源重組的原理用敲除靶載體取代內源DLC2基因，建立DLC2基因敲除小鼠模型；⑵采用PCR方法分析小鼠基因型并觀察DLC2基因

9、敲除小鼠的表型；⑶采用免疫沉淀方法確定DLC2在基因敲除小鼠模型中完全缺失；⑷采用X-Gal染色檢測DLC2在小鼠各個組織器官中的原位表達情況；⑸采用連續(xù)切片X-gal、CD31免疫組織化學染色確定DLC2在血管中的表達定位。
　　 結果及結論：①DLC2基因報告-敲除小鼠模型構建成功；②DLC2基因敲除小鼠可正常發(fā)育、成年和繁殖，未發(fā)現(xiàn)異常表型，提示DLC2對小鼠的生長發(fā)育繁殖可能不是必需的；③DLC2在小鼠肺、肝等組織高表達

10、；④DLC2在小鼠內皮細胞中高表達，提示DLC2可能參與血管生成反應過程。
　　 第三章 DLC2與血管生成關系的觀察。
　　 目的：利用DLC2基因敲除小鼠模型，觀察DLC2與血管生成的關系，探討DLC2在小鼠內皮細胞中高表達的生理學意義。
　　 方法：⑴通過基質膠血管生成誘導實驗和動脈環(huán)種植實驗，觀察DLC2缺失對內皮細胞遷移和血管生成的作用；⑵通過小鼠皮膚創(chuàng)傷實驗觀察DLC2缺失對創(chuàng)傷誘導的血管生成的作用；

11、⑶建立B16腫瘤移植模型，觀察DLC2缺失對腫瘤誘導的血管生成的作用。
　　 結果及結論：DLC2基因敲除小鼠對基質膠和腫瘤細胞誘導的血管生成反應較野生型小鼠強，但是DLC2基因敲除小鼠對創(chuàng)傷誘導的血管生成與野生型小鼠對比無明顯差異，說明DLC2參與某些類型血管生成反應，如腫瘤誘導的血管生成過程。
　　 第四章 DLC2缺失促進血管生成機制的探討。
　　 目的：探討DLC2缺失是否通過影響內皮細胞遷移和黏附能力而

12、參與調控血管生成的過程；RhoGAP是否是DLC2實現(xiàn)功能調控的關鍵機制。
　　 方法：⑴采用RNAi技術沉默DLC2在內皮細胞系HUVEC中的表達，觀察DLC2缺失對內皮細胞黏附、遷移和小管形成能力的影響；⑵采用雙重RNAi技術觀察RhoA活性的下調對DLC2缺失表型的逆轉。
　　 結果及結論：①在內皮細胞中沉默DLC2可削弱細胞黏附能力，促進細胞遷移和小管形成；②以上作用可被RhoA沉默逆轉，表明DLC2對血管生成的

13、調控是通過RhoA途徑實現(xiàn)的。
　　 全文小結：DLC2屬Rho GTP酶激活蛋白，它定位于黏著斑，并且在血管內皮細胞中高表達。DLC2對于小鼠胚胎的發(fā)育并非必需，但是它通過影響內皮細胞黏附、遷移和小管形成能力，參與血管生成的調控，此調控是通過其RhoGAP活性實現(xiàn)的。本研究第一次闡述了DLC2和血管生成的關系，揭示了DLC亞家族在生理學上的新功能，為黏著斑參與細胞生理學功能的調控做出了更進一步的分析，也為DLC2應用于抗腫瘤靶