PAK1與DLC2相互作用的研究.pdf

1、PAK1是p21-激活的激酶(PAK)中的一員，是在進(jìn)化過程中高度保守的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。以前的研究表明，在NIH3T3細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡時(shí)產(chǎn)生的p110C能和PAK1結(jié)合并抑制它的激酶活性，增加細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)?！　榱诉M(jìn)一步研究PAK1的功能，以PAK1為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎腦cDNA文庫，得到了與PAK1結(jié)合的蛋白質(zhì)一動(dòng)力蛋白輕鏈1(dDLC1)和動(dòng)力蛋白輕鏈2(DLC2)。PAK1和DLC2的相互作用是特異性

2、的，沒有檢測(cè)到DLC2與其它Ⅰ類PAKs的相互作用。構(gòu)建了PAK1的缺失突變體，用酵母雙雜交的方法進(jìn)一步明確了與DLC2相互結(jié)合所需的區(qū)域位于PAK1的第210-332位氨基酸之間，這可能就是只有PAK1與DLC2相互作用的原因。DLC1與PAK1的結(jié)合域是在羧基末端，而第88位的絲氨酸是PAK1的磷酸化位點(diǎn)。本文設(shè)計(jì)了六個(gè)DLC2的缺失突變體，用酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)DLC2與PAK1的結(jié)合域是在氨基末端的第1-42位氨基酸，這一區(qū)域包

3、含了DLCs中所有非同源的六個(gè)氨基酸；而高度同源的羧基端則沒有檢測(cè)到結(jié)合作用。隨后，我們?cè)隗w外結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，通過原核表達(dá)的GST-DLC2融合蛋白與NIH3T3細(xì)胞裂解液共孵育，證明了PAK1和DLC2在體外的結(jié)合。通過免疫共沉淀的方法證明了PAK1和HA-DLC2在體內(nèi)的相互作用，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察到兩者在核周的共定位，而未經(jīng)EGF處理的細(xì)胞則檢測(cè)不到這兩種相互作用。　　DLC2又稱為肌球蛋白輕鏈(MLC)是肌球蛋白V復(fù)合物(