真核延伸因子1A2在胰腺癌中的表達(dá)及其致癌機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的： 目前，胰腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未全部闡明，主要涉及一些抑癌基因的失活及癌基因的激活等。人類染色體20q13位點(diǎn)存在很多腫瘤相關(guān)基因的擴(kuò)增，其中人類真核延伸因子1A2位于20q13.3，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，它是一個(gè)管家基因，參與蛋白的翻譯過程。新近的研究發(fā)現(xiàn)，EEF1A2可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有著密切的關(guān)系。本研究擬探討EEF1A2在人類胰腺癌中的表達(dá)情況，構(gòu)建EEF1A2腺病毒表達(dá)質(zhì)粒，感染人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，通過體內(nèi)

2、實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)觀察EEF1A2如何影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及其致癌機(jī)制。 方法： 1.收集臨床手術(shù)標(biāo)本56例，包括正常胰腺組織、胰腺炎組織及胰腺癌組織，培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、BxPC-3、Patu8988，通過PCR及Western blot方法檢測(cè)EEF1A2 mRNA和蛋白在胰腺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況。與此同時(shí)，應(yīng)用免疫組化方法，檢測(cè)EEF1A2蛋白在胰腺組織中的表達(dá)定位情況及細(xì)胞內(nèi)分布。 2.采用R

3、T-PCR方法，以人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3的cDNA為模板，擴(kuò)增EEF1A2基因全長，定向插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316啟動(dòng)子的下游，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確后，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法，同腺病毒骨架質(zhì)粒pBHG35共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得含EEF1A2基因的腺病毒質(zhì)粒Ad5/F35-EEF1A2。病毒擴(kuò)增純化后，感染人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，經(jīng)PCR及Western印跡法檢測(cè)EEF1A2的表達(dá)情況。 3.將EEF1A2腺病毒表達(dá)

4、質(zhì)粒，感染EEF1A2低表達(dá)的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，應(yīng)用MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞儀、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)及黏附實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)感染前后細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。 4.建立人胰腺癌裸鼠移植瘤模型，瘤內(nèi)注射Ad5/F35-EEF1A2、Ad5/F35-GFP及PBS，檢測(cè)各組移植瘤的體積及重量，繪制生長曲線，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)PCNA及CD31在移植瘤組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步觀察腫瘤細(xì)胞增殖及血管形

5、成能力的改變。 5.將腺病毒Ad5/F35-EEF1A2及Ad5/F35-GFP分別感染人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，48小時(shí)后收獲細(xì)胞，應(yīng)用Affymetrix表達(dá)譜芯片檢測(cè)EEF1A2干預(yù)前后差異表達(dá)的基因，并采用Real-time PCR的方法對(duì)部分相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1.人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3及Patu8988中EEF1A2呈強(qiáng)表達(dá)，而SW1990細(xì)胞中的表達(dá)很低；在正常胰腺組織及慢性胰腺

6、炎組織中，幾乎檢測(cè)不到EEF1A2的表達(dá)，而在82％的胰腺癌組織中EEF1A2的表達(dá)異常增高。此外，EEF1A2蛋白主要位于胰腺癌導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，而在腺泡細(xì)胞及胰島細(xì)胞中未見顯著表達(dá)。 2.PCR產(chǎn)物電泳后可見長度約1392bp的目的條帶，酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)穿梭質(zhì)粒pDC316中插入了EEF1A2基因的DNA全長。經(jīng)PCR鑒定表明重組質(zhì)粒中含有EEF1A2片段。PCR及Western印跡法證實(shí)EEF1A2 mRNA和蛋白在

7、人胰腺癌細(xì)胞株SW1990中的表達(dá)。 3.MTT及細(xì)胞生長曲線顯示，EEF1A2可以顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖(p<0.05)；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EEF1A2組細(xì)胞克隆形成數(shù)目為810±85個(gè)，與GFP組(233±35個(gè))及PBS組(270±26個(gè))相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期提示，EEF1A2組S期細(xì)胞比例(54.9±10.1％)比GFP組(26.3±1.8％)、PBS組(26.5±1.5％)顯著增加(p

8、<0.05)，而G1期細(xì)胞比例顯著減少(28.5±5.1％vs54.1±4.4％，59.3±6.4％)(p<0.05)；體外劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，EEF1A2可顯著提高細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力(p<0.05)；侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EEF1A2組細(xì)胞的侵襲能力增加，48小時(shí)后穿膜細(xì)胞數(shù)為65.72±2.24個(gè)，與GFP組(20.10±5.82個(gè))及PBS組(23.26±5.23個(gè))相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Matrigel轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)提示，EEF1A2組(61.30±

9、5.68個(gè))穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于GFP組(32.04±3.60個(gè))及PBS組(32.33±2.51個(gè))；黏附實(shí)驗(yàn)提示，EEF1A2組細(xì)胞對(duì)I型、II型、IV型膠原、纖維結(jié)合蛋白、粘蛋白的黏附能力較其他兩組明顯增強(qiáng)(p<0.05)。 4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EEF1A2組的移植瘤體積顯著高于其他兩組(p<0.05)；干預(yù)3周后，EEF1A2組的腫瘤質(zhì)量(1.10±0.33g)顯著高于GFP組(0.68±0.15g)和對(duì)照組(0.64±0.

10、13g)；免疫組化的結(jié)果顯示EEF1A2組，GFP組及PBS組PCNA染色陽性細(xì)胞數(shù)分別為87.9±9.2％，60.3±8.5％，55.3±8.7％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；EEF1A2組微血管密度(20.32±5.21個(gè)/mm2)明顯高于GFP組(6.05±1.25個(gè)/mm2)及對(duì)照組(5.78±1.81個(gè)/mm2)(p<0.05)。 5.基因芯片結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染EEF1A2基因可以引起下游基因的變化，這些差異表達(dá)的

11、基因涉及多個(gè)方面包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等。推測(cè)EEF1A2基因可能通過參與調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮致癌作用。 結(jié)論： 1.相對(duì)于正常胰腺組織及胰腺炎組織，EEF1A2在人胰腺癌細(xì)胞株及胰腺癌組織中異常高表達(dá)，該蛋白主要位于胰腺癌導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞漿中。 2.成功構(gòu)建介導(dǎo)EEF1A2基因的復(fù)制缺陷型腺病毒，感染人胰腺癌細(xì)胞株SW1990后，可以表達(dá)EEF1A2mRNA與蛋白質(zhì)。