結(jié)腸腺瘤息肉蛋白N端片段抑制纖毛生長(zhǎng)的機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸腺瘤息肉蛋白(Adenomatous polyposis coli,APC)是一個(gè)腫瘤抑制因子,其突變與家族性結(jié)腸腺瘤息肉病(Familial adenomatous polyposis,FAP)的發(fā)生有關(guān)。纖毛是突出于細(xì)胞表面主要由微管構(gòu)成的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。纖毛在機(jī)體內(nèi)具有重要的生物學(xué)功能,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng),參與多種信號(hào)通路等。纖毛結(jié)構(gòu)和功能的異常會(huì)導(dǎo)致許多纖毛相關(guān)疾病的發(fā)生。在FAP中一些表現(xiàn)突出的腸外癥狀,例如纖維瘤、骨瘤、視網(wǎng)膜

2、色素上皮肥大等疾病都是纖毛相關(guān)性疾病,這暗示APC突變與纖毛異常之間存在必然聯(lián)系。APC-N是APC中高度保守的一個(gè)片段,在許多發(fā)生APC突變的個(gè)體中都會(huì)保留該片段。本課題主要對(duì)APC-N片段影響纖毛生長(zhǎng)的機(jī)制進(jìn)行研究,研究?jī)?nèi)容包括以下三部分:
　　第一部分:APC-N片段過表達(dá)對(duì)MDCK細(xì)胞纖毛生長(zhǎng)的影響。首先我們將質(zhì)粒pEGFP-C3和重組質(zhì)粒pEGFP-C3-APC-N轉(zhuǎn)染入MDCK細(xì)胞中,繼續(xù)培養(yǎng)3天誘導(dǎo)形成纖毛,west

3、ern印跡和免疫熒光染色結(jié)果顯示,APC-N片段在MDCK細(xì)胞中成功表達(dá)且主要定位在細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)一步我們用抗acetylated tubulin鼠單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的纖毛,免疫熒光染色后觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞纖毛生長(zhǎng)率,結(jié)果表明,在MDCK細(xì)胞中,過表達(dá)APC-N明顯抑制纖毛的形成。
　　第二部分:APC-N片段過表達(dá)對(duì) pericentrin定位、細(xì)胞周期進(jìn)展及 acetylated tub ulin表達(dá)的影響。在第一部分實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)

4、APC-N片段過表達(dá)抑制纖毛的形成,本部分將從以下幾方面來探討其抑制纖毛形成的機(jī)制:1,APC-N過表達(dá)對(duì)基體組成蛋白 pericentrin定位的影響;2,APC-N過表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展的影響;3,APC-N過表達(dá)對(duì)HDAC6和acetylated tubulin表達(dá)的影響。免疫熒光染色和western印跡結(jié)果表明,APC-N片段不是通過影響 pericentrin在纖毛基體的定位以及擾亂細(xì)胞周期進(jìn)程來抑制纖毛的形成。但細(xì)胞中acet

5、ylated tubulin的水平明顯降低,而HDAC6的表達(dá)是上調(diào)的,這表明APC-N通過上調(diào)HDAC6進(jìn)而降低acetylated tubulin的水平來抑制纖毛的形成。
　　第三部分:APC-N片段通過β-catenin/PI3K/AKT/GSK-3β正反饋環(huán)調(diào)節(jié)對(duì)纖毛生長(zhǎng)的抑制。為了進(jìn)一步研究APC-N片段抑制纖毛形成的機(jī)制,我們運(yùn)用western印跡檢測(cè)β-catenin和GSK3β的表達(dá),結(jié)果顯示,APC-N過表達(dá)導(dǎo)致

6、β-catenin表達(dá)升高,且GSK3β活性受到抑制。我們分別利用RNA干擾技術(shù)和GSK3β抑制劑SB216763敲減β-catenin和抑制GSK3β活性,結(jié)果表明,敲減β-catenin導(dǎo)致纖毛生長(zhǎng)率提高,而 GSK3β抑制劑 SB216763處理進(jìn)一步降低了纖毛生長(zhǎng)率。這表明β-catenin和GSK-3β參與調(diào)節(jié) APC-N導(dǎo)致的纖毛損傷。為了進(jìn)一步研究二者之間的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制,我們檢測(cè)了 GSK3β的上游調(diào)節(jié)信號(hào)分子 AKT。研

7、究發(fā)現(xiàn) APC-N過表達(dá)后, P-AKT(T308)水平升高,這表明 PI3K/AKT信號(hào)通路被激活。我們進(jìn)一步加入PI3K抑制劑和干擾β-catenin來檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路與β-catenin和 GSK3β的關(guān)系,結(jié)果表明,抑制劑LY294002處理后,β-cate nin和P-GSK-3β(Ser9)的水平降低。同時(shí),纖毛生長(zhǎng)率明顯提高;干擾β-catenin后,細(xì)胞中 P-AKT(Thr308)的水平降低。這些結(jié)果表明一

8、個(gè)正反饋環(huán)β-cate nin/PI3K/AK T/GSK-3β調(diào)節(jié)β-catenin和GSK-3β之間的相互作用。此外,為了分析PI3K/AKT信號(hào)通路是否直接參與APC-N誘導(dǎo)的纖毛損傷,我們同時(shí)用PI3K和GSK3β的抑制劑處理細(xì)胞檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞纖毛的生長(zhǎng)影響,結(jié)果表明兩種抑制劑處理只降低了P-AKT(T308)的水平,而并不影響GSK-3β,β-catenin和纖毛生長(zhǎng)率。這些結(jié)果表明PI3K/AKT信號(hào)通路并不直接影響APC-N