結(jié)腸腺瘤息肉蛋白N端片段影響纖毛形成和細(xì)胞粘附的機(jī)制研究.pdf

1、Adenomatous Polyposis Coli，即結(jié)腸腺瘤息肉蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)APC，參與Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞遷移、粘附、細(xì)胞極性、染色體正常分離等。纖毛是突出于細(xì)胞表面的一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。纖毛形成受損或結(jié)構(gòu)異常與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。細(xì)胞粘附包括細(xì)胞間粘附和細(xì)胞基質(zhì)間粘附，是惡性腫瘤始動(dòng)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。已有研究表明APC突變與纖毛形成受損和細(xì)胞粘附異常相關(guān)，但具體機(jī)制還不清楚。在多數(shù)APC突變的個(gè)體中都保留有其N(xiāo)端1至448個(gè)氨基酸的片段(命

2、名為APC-N1)，這一片段包括一個(gè)寡聚結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致APC同源二聚體結(jié)構(gòu)的形成，從而使蛋白失去活性。本課題主要對(duì) APC-N1片段影響纖毛形成和細(xì)胞粘附的機(jī)制進(jìn)行研究，研究?jī)?nèi)容包括以下幾部分：
　　第一部分：首先利用熒光定量 PCR和 Western印跡方法檢測(cè)了 MDCK-GFP和MDCK-APC-N1穩(wěn)定細(xì)胞株的Hedgehog信號(hào)通路中兩個(gè)主要成員Ptch1和Gli1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照MDCK-GFP細(xì)胞相比，MD

3、CK-APC-N1細(xì)胞中Ptch1和Gli1的表達(dá)上調(diào)，表明過(guò)表達(dá)APC-N1激活Hedgehog信號(hào)通路。分別利用RNA干擾技術(shù)和抑制劑GAN T61處理 MDCK-APC-N1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Gli1表達(dá)量降低時(shí)，細(xì)胞纖毛形成率顯著升高，表明過(guò)表達(dá) APC-N1是通過(guò) Hedgehog信號(hào)通路影響MDCK細(xì)胞纖毛形成。進(jìn)一步利用 RNA干擾技術(shù)敲減 MDCK-APC-N1細(xì)胞中β-catenin，發(fā)現(xiàn)敲減β-catenin導(dǎo)致Gli1的

4、表達(dá)量降低。以上結(jié)果表明APC-N1通過(guò)β-catenin影響Hed ge ho g信號(hào)通路，進(jìn)而抑制纖毛形成。
　　第二部分：利用熒光定量PCR檢測(cè)AurA的mRN A表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AurA表達(dá)上調(diào)。分別通過(guò)RNA干擾技術(shù)和TSA藥物處理敲減AurA和抑制HDAC6表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)AurA或HDAC6表達(dá)降低時(shí)，纖毛形成率明顯增加，表明過(guò)表達(dá)APC-N1是通過(guò)上調(diào)AurA/HDAC6表達(dá)而抑制纖毛形成。利用RNA干擾技術(shù)敲減Gl

5、i1檢測(cè)AurA和 HDAC6表達(dá)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gli1表達(dá)降低時(shí)，AurA和 HDAC6表達(dá)量減少。這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)APC-N1通過(guò)激活Hedgehog信號(hào)通路使AurA/HDAC6表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而抑制纖毛形成。
　　第三部分：利用細(xì)胞間粘附實(shí)驗(yàn)、熒光定量PCR、Western印跡檢測(cè)APC-N1對(duì)細(xì)胞間粘附和相關(guān)粘附分子E-cadherin的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APC-N1降低細(xì)胞-細(xì)胞間粘附和E-cadherin的表達(dá)。利

6、用結(jié)晶紫染色、熒光定量PCR、Western印跡檢測(cè)APC-N1對(duì)細(xì)胞基質(zhì)間粘附和相關(guān)粘附分子 CD29的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) APC-N1過(guò)表達(dá)提高細(xì)胞-基質(zhì)間粘附能力和CD29的表達(dá)。利用RNA干擾技術(shù)敲減β-catenin導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)上調(diào)卻對(duì)CD29沒(méi)有明顯影響，表明APC-N1通過(guò)β-catenin影響E-cadherin的表達(dá)。LY294002藥物處理MDCK-APC-N1細(xì)胞檢測(cè)E-cadherin和CD29的表達(dá)