家族性腺瘤性息肉病腺瘤干細(xì)胞的研究以及高頻電切對(duì)家族性腺瘤性息肉病的治療作用.pdf

1、關(guān)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，腫瘤由成熟細(xì)胞突變而來(lái)，是由均一的腫瘤細(xì)胞共同增殖構(gòu)成的，所有腫瘤細(xì)胞都有無(wú)限增殖能力。因此臨床上常以腫瘤體積是否縮小或消失作為衡量腫瘤療效的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn).但臨床上許多腫瘤患者，在手術(shù)切除腫瘤或經(jīng)過(guò)其他治療，病情已獲穩(wěn)定一段時(shí)間后，卻又出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，不能獲得徹底治愈。 新近研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤組織中存在極少量干細(xì)胞樣亞群，它具有無(wú)限增殖的潛能，在啟動(dòng)腫瘤形成

2、和生長(zhǎng)中起著決定性的作用，而其余的大多數(shù)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)短暫的分化，最終死亡。腫瘤生長(zhǎng)是腫瘤組織中極少量具有特殊表面標(biāo)志的腫瘤干細(xì)胞增殖的結(jié)果。這提示腫瘤治療應(yīng)針對(duì)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起決定性作用的腫瘤干細(xì)胞，而不是大部分無(wú)增殖、分化能力的腫瘤實(shí)體細(xì)胞。這可能促進(jìn)腫瘤治療學(xué)發(fā)生革命性改變。 家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP)是常見(jiàn)的遺傳性大腸腫瘤之一，約占總大腸腫瘤的1％，可分為經(jīng)

3、典型家族性腺瘤性息肉病(Classical FAP，CFAP)，衰減型家族性腺瘤性息肉病(Attenuated FAP，AFAP)和MYH相關(guān)性息肉病(MYH associatedFAP，MAP)三種，其臨床表現(xiàn)為青春發(fā)育期發(fā)生結(jié)直腸腺瘤，后逐漸增多，甚至滿布所有結(jié)直腸粘膜，如不及時(shí)干預(yù)治療，將發(fā)生癌變。 腫瘤干細(xì)胞理論提示FAP可能也來(lái)源于腺瘤干細(xì)胞(Adenomastem cells)。分離、培養(yǎng)、鑒定腺瘤干細(xì)胞并研究其性質(zhì)

4、具有重要意義。腫瘤干細(xì)胞研究的難點(diǎn)在于確定其特異性表面標(biāo)志或表面標(biāo)志的組合方案。應(yīng)用有針對(duì)性的抗原去檢測(cè)細(xì)胞亞群的表面標(biāo)志將節(jié)省大量的時(shí)間和研究經(jīng)費(fèi)，并有望形成高效的分選方案。 我們通過(guò)一種新的干細(xì)胞標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白DCAMKL-1來(lái)鑒定FAP腺瘤干細(xì)胞，并通過(guò)研究干細(xì)胞中某些蛋白的表達(dá)，研究腺瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的機(jī)制。 第一章家族性腺瘤性息肉病腺瘤干細(xì)胞的鑒定、分離、培養(yǎng)以及相關(guān)蛋白的研究 目的：通過(guò)一種新的胃

5、腸干細(xì)胞標(biāo)志物DCAMKL-1對(duì)FAP患者腺瘤干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并建立腺瘤細(xì)胞分離和培養(yǎng)的辦法。研究PCNA、β-catenin、COX-2等蛋白在腺瘤細(xì)胞中的表達(dá)及這些蛋白與腺瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 方法：采用免疫組化的方法，對(duì)正常結(jié)腸粘膜，F(xiàn)AP腺瘤上皮及癌變的腺瘤上皮進(jìn)行DCAMKL-1染色，觀察DCAMKL-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的位置。對(duì)比MSI-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的位置，對(duì)腺瘤細(xì)胞進(jìn)行Hoechst染色。觀察PCNA、β-cateni

6、n、COX-2等蛋白在腺瘤細(xì)胞的表達(dá)，并探討β-catenin、COX-2在正常結(jié)腸粘膜，F(xiàn)AP腺瘤上皮及癌變的腺瘤上皮中表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果：在正常結(jié)腸粘膜，F(xiàn)AP腺瘤上皮及癌變的腺瘤上皮中，DCAMKL-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞主要位于結(jié)腸隱窩的底部，與用于標(biāo)記腸干細(xì)胞的MSI-1陽(yáng)性表達(dá)位置一致，且隨著病變的發(fā)展，在腺瘤中逐漸呈現(xiàn)表達(dá)增多的現(xiàn)象。DCAMKL-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞細(xì)胞核不能為Hoechst33342染色。PCNA、β-ca

7、tenin、COX-2的表達(dá)均與腺瘤病變的發(fā)展相關(guān)。 結(jié)論：DCAMKL-1是一種新奇的胃腸干細(xì)胞的標(biāo)記物，其陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞可能為家族性腺瘤性息肉病及正常結(jié)腸粘膜的干細(xì)胞。對(duì)腺瘤的治療關(guān)鍵在于切除腺瘤干細(xì)胞，以及抑制與腺瘤病情發(fā)展呈正相關(guān)的COX-2蛋白等。 第二章高頻電切腺瘤性息肉對(duì)家族性腺瘤性息肉病裸鼠病程的影響及轉(zhuǎn)歸 目的：建立FAPmin裸鼠模型并考察高頻電切治療對(duì)FAPmin裸鼠結(jié)腸腺瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸

8、的影響。 方法：采用N-二乙基亞硝胺灌胃誘變的方法建立了FAPmin裸鼠模型；與高頻電切治療后1、3、6、9、12個(gè)月，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)APC、Lgr5、Musashi-1及PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的變化；半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)APC、Lgr5、Musashi-1及PTEN mRNA表達(dá)水平的變化；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)腺瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化。 結(jié)果：高頻電切治療后1、3、6、9、12個(gè)月，模型組裸鼠結(jié)

9、腸組織中APC、Lgr5、Musashi-1蛋白及基因表達(dá)水平顯著升高，而電切組裸鼠上述分子的表達(dá)水平則顯著下降，兩組的變化存在差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；兩組腺瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化存在差異，模型組腺瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)從1月到12月的變化范圍為(8.29±0.98)％～(7.76±1.34)％，對(duì)照組的變化范圍為(20.08±1.21)％～(32.79±3.62)％，兩組間及組內(nèi)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上存在的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01

10、)。 結(jié)論：采用N-二乙基亞硝胺灌胃誘變的方法能夠建立FAPmin裸鼠模型；經(jīng)高頻電切治療FAP，裸鼠的病情得到了控制，并且隨著治療后時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)APmin裸鼠能夠逐漸恢復(fù)健康。 第三章舒林酸聯(lián)合內(nèi)鏡下高頻電切治療家族性腺瘤性息肉病的臨床研究 目的：探討舒林酸聯(lián)合內(nèi)鏡下高頻電切治療家族性腺瘤性息肉病的新方法及臨床療效。 方法：20例經(jīng)結(jié)腸鏡檢查和組織病理學(xué)檢查確診的家族性腺瘤性息肉病患者，隨機(jī)分為兩組，

11、每組10例：舒林酸聯(lián)合內(nèi)鏡組、舒林酸組。舒林酸聯(lián)合內(nèi)鏡組患者，行內(nèi)鏡下高頻電凝、電切及熱活檢鉗治療結(jié)束后即口服舒林酸40.mg/d，療程為12個(gè)月；舒林酸組患者，僅口服舒林酸40.mg/d，療程為12個(gè)月。兩組患者均為每4個(gè)月結(jié)腸鏡復(fù)查一次，觀察腺瘤的數(shù)目、類(lèi)型、異型增生程度以及治療后腺瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)變化。 結(jié)果：舒林酸聯(lián)合內(nèi)鏡組于治療后4、8、12個(gè)月腺瘤消退率分別為90.96％、95.66％和98.81％，而舒林酸組分別為8

12、0.08％、85.35％和89.78％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。舒林酸聯(lián)合內(nèi)鏡組患者，經(jīng)治療后腺瘤Ⅲ級(jí)異型增生程度明顯降低。舒林酸聯(lián)合內(nèi)鏡組于治療后4、8、12個(gè)月腺瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(20.08±1.21)％、(25.67±2.07)％、(32.79±3.62)％，舒林酸組分別為(13.29±0.98)％、(19.83±1.56)％、(25.18±2.31)％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 結(jié)