siRNA干擾Smo基因?qū)θ烁伟〩epG2細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、肝癌是世界常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其中肝細(xì)胞癌（hepatocelluar carcinoma， HCC)是最主要的類型，其特點(diǎn)是侵襲力強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，它由多種基因參與，涉及多條信號(hào)通路。在我國(guó)，肝癌發(fā)病率極高，約占全世界的42.5％。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，我國(guó)肝癌死亡率為20～40/10萬(wàn)，高居癌癥死亡率的第2位，本文應(yīng)用Western blot及半定量RT-PCR技術(shù)，旨在觀察Smo基因在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)肝癌HepG

2、2細(xì)胞影響的作用。RT-PCR及Westem blot檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞中Smo基因的表達(dá)；利用RNAi技術(shù)siRNA脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞smo mRNA被降解后對(duì)細(xì)胞的影響。探討Smo基因在肝癌細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的作用。
　　目的：探討Smo基因在肝癌細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的作用及與肝癌的關(guān)系，為Smo基因在Sonic hedgehog信號(hào)通路上能否靶向治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)

3、依據(jù)。
　　方法：⑴細(xì)胞來(lái)源：本實(shí)驗(yàn)所使用的人肝癌HepG2細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)老師贈(zèng)與。主要試劑：Trizol（總RNA提取試劑異硫氰酸胍)、FSK-100(RT-PCR試劑盒)、兔抗人Smo濃縮型多克隆抗體（一抗）、Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒、辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體(二抗)、MTT等。主要設(shè)備：C02恒溫孵育箱、PCR擴(kuò)增儀、流式細(xì)胞儀、轉(zhuǎn)印電印電泳槽、DYY-B型電泳儀。⑵細(xì)胞培養(yǎng):HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)基(含1.

4、0mM丙酮酸鈉，0.1mM非必需氨基酸和1.5克/升碳酸氫鈉的EMEM，添加10%胎牛血清。)于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。⑶RT-PCR檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞Smo mRNA的表達(dá)。⑷Western blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞Smo蛋白的表達(dá)。⑸siRNA序列的設(shè)計(jì)與合成：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3，及1對(duì)非特異性siRNA。⑹細(xì)胞轉(zhuǎn)染及siRNA篩選：分成A、B、C、D、E五組：A

5、組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-1組，B組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-2組、C組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-3組，D組為陽(yáng)性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染非特異性siRNA)，E組為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染時(shí)只加Lipofectamine，不加任何siRNA)，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。⑺RNAi技術(shù)分別將Smo siRNA轉(zhuǎn)染入各組人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)。⑻RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后各組細(xì)胞的Smo mRNA表達(dá)，比較3組特異組表達(dá)的效果，篩選出抑制最有效的siRNA，后繼

6、實(shí)驗(yàn)中均以該特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。⑼再將HepG2細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染。⑽噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。⑾統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析：數(shù)據(jù)采用SPSSl8．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：①Western blot及半定量RT-PCR結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)有Smo蛋白及Smo mRNA的高表達(dá)。②按照分組，轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR結(jié)果顯示：si

7、RNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組及陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組的HepG2細(xì)胞的Smo mRNA表達(dá)水平有顯著性差異(F=382.0，P<0．001)，siRNA-1組表達(dá)水平最低，siRNA-2組次之，兩組分別與陰性對(duì)照組比較，差異均有顯著性(P<0.001)；siRNA-3組、陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著(P>O．05)；siRNA-1組與siRNA-2組比較，差異亦有顯著性(P<0.001)。根據(jù)圖形計(jì)算siR

8、NA-3組無(wú)明顯抑制抑制作用，siRNA-1組、siRNA-2組的抑制率分別為65．72％、46．17％，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇siRNA-1組作為實(shí)驗(yàn)組。③于轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞（siRNA-1組、陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組）的增值水平通過(guò)RT-PCR顯示有顯著性差異(F=4.628，P<0.001)，實(shí)驗(yàn)組（siRNA-1組）細(xì)胞的增值水平在不同時(shí)間點(diǎn)均顯著低于陰性對(duì)照(P<0.05)。④siRNA轉(zhuǎn)染48h后，siRNA-1組、

9、陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組的HepG2細(xì)胞的凋亡率分別為23.5％、9.8％、3.5％，siRNA-1組細(xì)胞凋亡率較陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=14．813，P<0.001)
　　結(jié)論：⑴肝癌的發(fā)生與SHH信號(hào)通路中Smo基因的高表達(dá)相關(guān)；并且Smo基因的高表達(dá)影響到肝癌HepG2細(xì)胞的增殖與凋亡。⑵通過(guò)RNAi技術(shù)，應(yīng)用Smo siRNA轉(zhuǎn)染降解肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)的Smo mRNA實(shí)驗(yàn)是可行的。⑶利用