超聲聯(lián)合SonoVue促進(jìn)siRNA survivin對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、肝癌是我國(guó)常見(jiàn)腫瘤之一,目前常用的治療方法有手術(shù)切除、藥物治療和生物治療等,但由于發(fā)現(xiàn)較晚,治療效果往往很不理想。越來(lái)越多研究表明:多基因、多階段的癌基因或抑癌基因?yàn)楦伟┌l(fā)生、發(fā)展的分子學(xué)基礎(chǔ)。因此肝癌的基因治療成為研究熱點(diǎn)。生存素(survivin)是腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)的抑制細(xì)胞凋亡基因之一,在肝癌細(xì)胞中亦高效表達(dá),目前己成為腫瘤發(fā)生機(jī)制和靶向治療研究中的熱點(diǎn)。RNA干擾技術(shù)是指將與靶基因mRNA序列同源的短的雙鏈RNA(小干擾R

2、NA,siRNA)導(dǎo)入細(xì)胞,可導(dǎo)致靶基因mRNA降解和基因沉默的一項(xiàng)基因治療新技術(shù)。本研究應(yīng)用靶向survivin的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。基因治療中的一個(gè)重要步驟就是如何將外源治療性基因或藥物有效導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)。目前常用的基因方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒感染等,但都存在效率低、安全性差等缺點(diǎn)。超聲聯(lián)合微泡造影劑介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染是近年來(lái)新興的基因轉(zhuǎn)染技術(shù),具有轉(zhuǎn)染率高、操作簡(jiǎn)便、安全性高等特點(diǎn)。本研究用第二代微泡造影劑SonoVu

3、e聯(lián)合超聲介導(dǎo)轉(zhuǎn)染survivin siRNA至HepG2細(xì)胞,以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步凋亡。希望能將超聲造影技術(shù)與小干擾RNA技術(shù)相結(jié)合,探討一種新的基因轉(zhuǎn)染方法。
　　 第一部分超聲輻照聯(lián)合微泡造影劑SonoVue介導(dǎo)綠色熒光蛋白pEGFP-N1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：研究微泡造影劑與超聲輻照是否能提高綠色熒光蛋白質(zhì)粒在人肝癌細(xì)胞HepG2中的轉(zhuǎn)染率。
　　 方法：首先配置造影劑溶液。SonoV

4、ue(聲諾維)為第二代聲學(xué)造影劑,每瓶含六氟化硫氣體59mg及凍干粉25mg。將5ml0.9％生理鹽水注入SonoVue藥瓶中,用力震蕩,使凍干粉完全溶解,混合均勻后形成懸濁液。實(shí)驗(yàn)使用的超聲儀為意大利百勝公司mylab25超聲診斷儀,腹部探頭,頻率設(shè)定為3.5MHz,機(jī)械指數(shù)(MI)0.1-1.1。超聲輻照的方法為將超聲探頭發(fā)射面向上置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板下方,加以少量超聲耦合劑,探頭緊貼于培養(yǎng)板下方,均勻移動(dòng)探頭。將培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞

5、分為(1)不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞對(duì)照組(2)質(zhì)粒+超聲輻照組、(3)質(zhì)粒+造影劑組、(4)造影劑濃度組:造影劑濃度分別為5％(7.5μl)、10％(15μl)、20％(30μl)、40％(60μl),80％(120μl)和100％(150μl),超聲輻照時(shí)間5min,MI0.6。(5)超聲機(jī)械指數(shù)組:MI分別為0.2、0.4、0.6、1.0、1.1,超聲輻照時(shí)間5min,SonoVue濃度為第4組實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染率最高的濃度。(6)輻照時(shí)間

6、組:分為1min、3min、5min、10min、20min。SonoVue濃度為第4組實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染率最高的濃度,機(jī)械指數(shù)為第5組實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染率最高的MI數(shù)值。將含有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-NI轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2,24小時(shí)后以熒光顯微鏡觀察人肝癌細(xì)胞HepG2中的綠色熒光蛋白表達(dá)情況并用流式細(xì)胞儀測(cè)算轉(zhuǎn)染率。
　　 結(jié)果：造影劑濃度組中,當(dāng)濃度為40％時(shí)熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率最高(18.11±1.63)％,與其他

7、各組相比有顯著性差異(P<0.01)；而細(xì)胞生存率在造影劑濃度≥80％后顯著下降,與前幾組相比均有顯著性差異(P<0.01)。機(jī)械指數(shù)組中MI=1.0時(shí)熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率最高(27.03±2.16)％,與其他各組相比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率有顯著性差異(P<0.01)；細(xì)胞生存率除MI=1.1組外其余各組均≥95％。超聲輻照時(shí)間組中5min組熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率最高(27.46±2.31)％,與其他各組相比有顯著性差異(P<0.05)；細(xì)胞生存率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)

8、顯著下降,10min組和20min組與其他各組相比有顯著性差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論：微泡造影劑SonoVue和超聲輻照能夠?qū)EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞內(nèi),其最佳的轉(zhuǎn)染條件為40％造影劑濃度,機(jī)械指數(shù)1.0,輻照時(shí)間5min。
　　 第二部分小干擾RNA生存素(siRNA-survivin)誘導(dǎo)Hep2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：篩選能有效抑制survivin基因表達(dá)的小干擾RNA(siR

9、NA),并轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞,觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞survivin mRNA水平及細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：首先構(gòu)建survivin與EGFP融合基因表達(dá)載體。根據(jù)人survivin的基因序列及siRNA的基本設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)3段survivin siRNA靶位點(diǎn),用兩步PCR法擴(kuò)增siRNA表達(dá)框。將質(zhì)粒psurvivin-EGFP與siRNA表達(dá)框共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,篩選出最有效的survivin siRNA。將篩選得到的有效s

10、iRNA表達(dá)框用Taqase處理20分鐘,再用T-A克隆的方法將siRNA表達(dá)框插入載體pMD18T(TaKaRa產(chǎn)品),得到的重組質(zhì)粒即為表達(dá)載體。將得到的survivin siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞,分析survivin基因的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況。同時(shí)以不同濃度Docetaxe分別處理轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照空載體的HepG2細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞的存活率,觀察HepG2細(xì)胞內(nèi)survivin表達(dá)的下調(diào)是否影

11、響細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。
　　 結(jié)果：篩選出了1段能高效抑制survivin表達(dá)的siRNA。轉(zhuǎn)染靶向survivin基因第69～86 nt的siRNA表達(dá)載體后,每24h對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行Annexin V和PI染色分析,結(jié)果可見(jiàn)Annexin V陽(yáng)性而PI陰性的凋亡細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后1、2、3、4天的比率分別為4.6％、7.8％、12.3％和36.4％,Annexin V和PI染色均陽(yáng)性的壞死細(xì)胞在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于2.0％,轉(zhuǎn)染

12、空載體pUC18的HepG2細(xì)胞在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡率均低于2.0％。抑制survivin的表達(dá)能明顯增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)Docetaxe的敏感性。當(dāng)Docetaxe濃度≥10ng/ml時(shí),siRNA質(zhì)粒表達(dá)組與對(duì)照空載體組以及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞組相比,結(jié)果有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：利用RNA干擾技術(shù)能有效抑制survivin基因表達(dá)并誘導(dǎo)人肝癌Hep2細(xì)胞凋亡,為進(jìn)一步靶向survivin分子的體內(nèi)抗腫瘤治療研究奠定

13、了基礎(chǔ)。
　　 第三部分超聲聯(lián)合SonoVue介導(dǎo)siRNA-survivin促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：比較傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與在脂質(zhì)體加入微泡造影劑SonoVue聯(lián)合超聲輻照轉(zhuǎn)染siRNA-survivin至HepG2細(xì)胞并促使肝癌細(xì)胞凋亡的效果,探討超聲聯(lián)合微泡造影劑在基因轉(zhuǎn)染中的可行性。
　　 方法：將培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞分為四組:分別為對(duì)照組、造影劑+超聲輻照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體+微

14、泡造影劑SonoVue+超聲輻照組,其中SonoVue濃度40％,超聲輻照條件為MI1.0,輻照時(shí)間5min,將siRNA-survivin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后分別以Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞survivin表達(dá)、RT-PCR分析HepG2細(xì)胞中的survivin mRNA的表達(dá)情況以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。
　　 結(jié)果： Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞

15、survivin蛋白的表達(dá)情況:與對(duì)照組相比其他各組survivin蛋白表達(dá)均有不同程度下調(diào),其中脂質(zhì)體+造影劑+超聲輻照組最為明顯。RT-PCR法分析HepG2細(xì)胞中的survivin mRNA的表達(dá)情況顯示脂質(zhì)體+造影劑+超聲輻照組與各組相比有顯著性差異(P<0.05),而脂質(zhì)體組與造影劑+超聲輻照組相比也有顯著性差異(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:脂質(zhì)體+造影劑+超聲輻照組的凋亡指數(shù)(AI)為(23.05±0.54)％,