RNA干擾對(duì)HepG2細(xì)胞AFP基因表達(dá)的影響.pdf

1、山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干擾對(duì)HepG2細(xì)胞AFP基因表達(dá)的影響姓名：張國(guó)英申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：病理學(xué)指導(dǎo)教師：梁建芳20050606山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干擾對(duì)HepG2$BflAFP基因表達(dá)的影響摘要目的：研究RNA干擾(RNAi)技術(shù)對(duì)HepG2細(xì)胞AFP基因表達(dá)的影響，以及抑制AFP表達(dá)后對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及凋亡作用的影響。方法：第一部分RNA干擾(RNAinterferenceRNAi)抑制HepG2細(xì)胞A

2、FP基因表達(dá)方法的建立。l_目標(biāo)基因序列的選擇及質(zhì)粒載體構(gòu)建，經(jīng)B1ast軟件查對(duì)及序列同源性分析，選擇兩條目標(biāo)基因序列——AFPl與AFP2，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesi卜卜AFPl(含綠色熒光蛋白編碼序列)及pGenesi卜2一AFP2。2用陽(yáng)離子脂質(zhì)體META／質(zhì)粒載體pGenesil一1AFPI不同劑量及濃度配比轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率，并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液AFP的量的變化，篩選出最佳陽(yáng)離子脂質(zhì)體META／質(zhì)粒載

3、體pGenesil一卜AFPl配比。第二部分RNA干擾技術(shù)對(duì)HepG2細(xì)胞AFP基因表達(dá)的影響。1轉(zhuǎn)染試劑METAFECTENE／質(zhì)粒載體混合液配制及轉(zhuǎn)染細(xì)胞。2采用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24，48，72小時(shí)培養(yǎng)上清液中AFP的含量。3采用間接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀(guān)察處理組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)AFP基因表達(dá)情況，了解在細(xì)胞水平pGenesi卜AFPsiRNA對(duì)AFP表達(dá)的抑制作用。第三部分siRNA抑制AFP表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及

4、凋亡的影響。分別應(yīng)用MTT比色法，DNAFragmentation及檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平來(lái)觀(guān)察。結(jié)果：1篩選出最佳的陽(yáng)離子脂質(zhì)體META／質(zhì)粒載體pGenesil一1一AFPl轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配比為8ul：2511g。2轉(zhuǎn)染pGenesi卜卜siAFPl與pGenesil—2一siAFP2的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，AFP含量下降明顯(PO01)：pGenesil一卜siAFPl實(shí)驗(yàn)組與pGenesi卜2一siAFP2實(shí)驗(yàn)組比較，AFP含量在各

5、時(shí)段均顯著下降。3pGenesi卜卜siAFPl的實(shí)驗(yàn)組干擾后DNAFragmentation觀(guān)察無(wú)細(xì)胞凋亡，但是MTT比色法發(fā)現(xiàn)siRNA—AFPl的實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，對(duì)細(xì)胞增殖抑制率最高達(dá)5135％。。而且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的camp濃度(1564umol／h)明顯低于各對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度(PO01)。結(jié)論：RNA干擾技術(shù)能有效地抑制HepG2細(xì)胞AFP基因表達(dá)，這種方法不僅對(duì)體外研究AFP基因功能有一定意義，而且