貂、狐、貉源犬瘟熱病毒分離鑒定與分子生物學特性研究.pdf

1、犬瘟熱病毒(CDV)屬于副粘病毒科(family Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(genusMorbillivirus)成員，常引起貂、狐、貉等毛皮動物、犬以及熊貓、虎等珍稀動物大批發(fā)病，由于犬瘟熱(CD)感染性強、發(fā)病急、死亡率高，以及與人類亞急性硬化性全腦炎(subacute sclerosing panencephalitis，SSPE)和多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosing，MS)可能存在聯(lián)系，一直成

2、為國內(nèi)外學者研究的熱點，但毛皮動物CDV病原學、病理學、診斷、免疫學等研究目前尚不深入.2006年6月至10月間，山東、河北、遼寧等地毛皮動物群大面積暴發(fā)犬瘟熱.本研究在該病流行病學、臨床表現(xiàn)、剖檢病變及病理組織學研究基礎上，從臨床病料中分離獲得5個CDV分離株，并進一步從該病毒基因特征、Real-time RT-PCR快速診斷方法和DNA疫苗免疫效果等方面進行了分子生物學特性研究，為毛皮動物群CD防控奠定基礎。 1.貂、狐、貉

3、群犬瘟熱病理學研究 對2006年6月至10月間山東、河北等地區(qū)的部分毛皮動物養(yǎng)殖場發(fā)生疑似犬瘟熱的疫情進行了流行病學、臨床表現(xiàn)以及剖檢變化觀察和分析，并對采集的病料進行了病理學研究：結果表明，這起疫情主要是由攜帶CDV的貉、貂調(diào)運而促進病毒傳播感染引起.發(fā)病動物割檢病變以全身臟器出血性變化為特征，病情及病變嚴重程度依次為貉>狐貍>水貂.通過對發(fā)病狐貍、貉、水貂的肺臟、肝臟、腦、腎臟、膀胱等臟器病理學比較，在病變程度上水貂與狐貍、

4、貉有差異.同一種動物，依病程、病型及有無并發(fā)癥等因素，病理學變化也存在差異。 2.貂、狐、貉源犬瘟熱病毒的分離鑒定與生物學特性研究 對流行病學調(diào)查、臨床癥狀檢查、病理剖檢以及病理組織學檢查診斷為CDV陽性的發(fā)病貉、狐貍和水貂，取其肝，脾、肺、淋巴結及腦混合研磨處理后，分別接種能穩(wěn)定表達犬信號淋巴細胞活性分子(SLAM)的Vero-DST細胞進行病毒分離，并通過電鏡形態(tài)觀察、RT-PCR測，理化特性測定和人工感染試驗進行鑒

5、定.結果為：5份不同來源的病料接種Vero-DST細胞，36-96h后均產(chǎn)生明顯CPE；病毒TCID50分別為10-5.2～-7.3/ml；電鏡觀察可見多形態(tài)病毒粒子，大小為110～500nm； CDV特異性引物RT-PCR檢測5個分離毒株均為陽性；除雞、鵝紅細胞呈微弱陽性外，其余均未見血凝作用；對乙醚、氯仿和甲醛敏感，對酸、堿和熱的抵抗力比較弱；5個病毒分離株對乳鼠的LD50分別為2×10-3.8～-4.8/ml，對實驗兔無致病性，對

6、貉有明顯致病性作用，從而均鑒定為犬瘟熱病毒(CDV)，分別命名為CDV/SD/RD06/HT-P(貉源)、CDV/SD/RD06/THD1(貉源)、CDV/SD/M06/HD(貂源)、CDV/SD/M06/LN(貂源)和CDV/SD/F06/HB(狐源)。 3.貂、狐、貉源犬瘟熱病毒不同分離株H和N基因序列分析 用RT-PCR方法對分離的5個CDV分離株的H基因和N基因進行了擴增，并分別將其克隆到PGEMT-Vector

7、,進行序列測定.然后與GenBank中己報道的CDV毒株相比較.結果為：(1)H基因5個分離株H基因nt序列同源性均達到97.5％以上，與國內(nèi)疫苗株chn同源性為90.5～91.8％.5個CDV分離株H基因推導的aa序列同源性比較表明：HT-P與THD1的aa同源性為100％，二者與其他分離毒株間aa序列同源性差別大，分別為87.9％～99.1％：與chn同源性普遍較低，為89.7％～91.8％.而chn與Onderstepoort、C

8、onvac有著很高的同源性關系(nt同源性分別為96.8％和97.2％；aa同源性分別為97.1％和95.6％).(2)N基因5個分離株N基因nt序列同源性均達到94.5％以上，HT-P與THD1的同源性最高(99.8％).國內(nèi)疫苗株chn與分離株的nt序列同源性普遍較低(90.9～93.5％)，而與疫苗株Onderstepoort的nt同源性高，達到97.1％.從N蛋白aa序列看，分離株之間除HT-P、THD1與HD aa序列同源性較

9、高(99.0％以上)外，其他分離株之間aa同源性低.而Chn與Onderstepoort有著很高的同源性關系，同源性比例達97.3％.本研究結果提示，HD和LN潑病區(qū)域相距較遠，但具有較高的同源性，而與HB具有相對較低的nt同源性，提示野毒株在易感動物上可能存在種屬差異。此外，分離毒株H和N蛋白免疫原性可能與疫苗株有較大差別，可能與CD免疫失敗有關。 4.犬瘟熱病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的研究 按照CDV N基

10、因序列，設計合成了特異性引物和探針，經(jīng)各反應條件的優(yōu)化，建立了CDV的Real-time熒光定量RT-PCR檢測技術，用20pmol/mL的引物濃度各1uL和20pmol/mL的探針濃度0.3uL,獲得的熒光信號最強，曲線平滑.敏感度為1.24×10-3ng/mL的病毒RNA；與NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不發(fā)生交又反應.試驗重復性的變異系數(shù)(CV)分別為2.3％、2.5％和4.2‰對采集的57份臨床樣品進行檢測，熒光RT-PC

11、R檢測陽性檢出率為93％(53/57)，而BIOINDIST BIT RAPID CDV試劑盒、常規(guī)RT-PCR陽性檢出率分別為70.2％(40/57)和71.9％(41/57)，與BIOINDIST試劑盒和常規(guī)RT-PCR的符合率分別為77.2％和78.9％，而BIOINDIST試劑盒與常規(guī)RT-PCR符合率達98.2％.結果表明，本研究建立的檢測CDV的熒光RT-PCR方法具有快速、特異、敏感、可定量，并可同時檢測大量樣品等優(yōu)點，能

12、用于CDV感染的早期診斷和海關檢疫。 5.貉源犬瘟熱病毒H、F和N基因真核表達質(zhì)粒的構建與鑒定 將貉源CDV分離株的H、F和N (N1，N2)基因經(jīng)RT-PCR擴增后，連接到pMD18-T載體，對比測序結果表明各基因序列正確，并且符合閱讀框規(guī)則。然后將各基因亞克隆到真核表達栽體pIRESlneo中，經(jīng)PCR方法和限制酶酶切鑒定成功構建了四種重組真核表達質(zhì)粒，分別命名為pIRES T-N1、pIRES T-N2、pIRES

13、 T-H、pIRES T-F.用構建的真核重組質(zhì)粒轉染VERO-DST細胞，用抗CDV陽性血清進行Western blot分析，結果表明，各重組質(zhì)粒可以表達相應的目的蛋白。 6.貉源犬瘟熱病毒H、F和N基因表達質(zhì)粒DNA免疫保護效率研究 本研究將pIRES T-H、pIRES T-F、pIRES T-N1和pIRES T-N2四個真核表達質(zhì)粒作為基因疫苗，單獨或混合分組對42只小鼠和21只斷奶貉進行了動物免疫試驗，對免疫

14、的實驗貉進行了攻毒保護實驗，并與chn弱毒疫苗、進口CDV-CPV二聯(lián)疫苗進行了比較。結果為： (1)小鼠免疫試驗 采用構建的基因疫苗免疫小鼠2次后開始有抗體反應，免疫第3次后小鼠血清中抗CDV ELISA抗體和中和抗體水平與免疫前和空載體陰性對照相比明顯增高(p<0.05).從ELISA抗體滴度比較，四種基因疫苗聯(lián)合免疫組(簡稱“四基因組”)與pIRES T-H組、pIRES T-F組和pIRES T-N1+pIRES

15、 T-N2組差異不顯著，但其中和抗體水平明顯高于單一基因疫苗組(p<0.05).chn組中和效價與四基因組差異不顯著，但ELISA滴度明顯高于四基因組。CDV-CPV組ELISA抗體滴度和中和抗體滴度均明顯高于各基因疫苗組(p<0.05)。 (2)貉免疫保護試驗 基因疫苗免疫貉后，血清中CDV ELISA抗體滴度(OD650值)組間差異不顯著，但是四基因組比單獨免疫組有較高抗體滴度。講基因疫苗經(jīng)3次免疫貉后，四基因組與其

16、他3組相比中和滴度較高。四基因組與chn組、CDV-CPV組免疫后都有抗體升高，但是chn組上升較低，CDV-CPV組上升較高.CDV-CPV組中和抗體水平明顯高于四基因組2個滴度.攻毒實驗表明，除四基因組外，pIRES T-H、pIRES T-F、pIRES T-NI+pIRES T-N2組各有不同程度死亡.Chn組死亡1只，而CDV-PPV組均存活。 剖檢結果可以看出，免疫組自然死亡貉中，pIRES T-H組、pIRES T

17、-F組和pIREST-N1+pIRES T-N2組表現(xiàn)中度至嚴重病理變化，而chn組死亡1只貉病變程度相對較低.試驗結束實施安樂死的貉均呈輕微至中度變化。排毒檢測結果表明，試驗貉中除了CDV-PPV組的2只和四基因組中的1只一直沒有檢測到CDV特異核酸外，其他樣品都在不同采樣時段或采集的不同樣品中檢測到。其中血液中檢出時間最早，其次為眼結膜、直腸拭子。眼結膜拭子的檢出率和檢出時間較直腸拭子的高，檢出時間較早。自然死亡貉組織都擴增出了CD