斑嘴鴨源新城疫病毒的分離鑒定及分子生物學(xué)特性的研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease,ND)仍然是威脅養(yǎng)禽業(yè)的一種主要疾病，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的損失，國際獸醫(yī)局(Office Internation des Epizooties,OIE)將其與高致病性禽流感一起列為危害養(yǎng)禽業(yè)的必須報告的疾病。自1997年以來，華南和華東地區(qū)部分省市發(fā)生了新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染鵝的病例，雖然各地采取了積極的防治措施，但該病仍然逐漸蔓延、流行。有不少

2、學(xué)者對此進(jìn)行了研究，但有關(guān)病原的生物學(xué)特性及流行病學(xué)等方面，仍存在很多疑問。 1、斑嘴鴨源新城疫病毒的分離純化與毒力鑒定 本研究從鹽城國家自然保護(hù)區(qū)的斑嘴鴨群中，采集肛拭子，經(jīng)實驗室常規(guī)處理接種雞胚，收集24h后致死雞胚的尿囊液，采用病毒蝕斑純化技術(shù)純化病毒，結(jié)果分離獲得三株病毒：通過透射電鏡觀察，新分離病毒呈典型的新城疫病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)：以抗NDV雞多抗血清為一抗作間接免疫熒光試驗(IFA)，結(jié)果觀察到特異性的亮綠色

3、熒光，證明該病毒為新城疫病毒，分別命名為7XJS061、8XJS062、12JS063。用這些病毒接種雞胚，結(jié)果雞胚死亡，胚體全身出血。病毒的主要致病指數(shù)如雞胚平均死亡時間(MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)接種指數(shù)(ICPI)及組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID<,50>)的檢測結(jié)果表明，3株病毒的MDT分別為52h、48h、46h，ICPI為1.523(L2JS063)，TCID<,50>分別為10<'5.625>/0.1ml、10<'7.25>/

4、0.1ml、10<'8.625>/0.1ml。試驗結(jié)果證明來源于野生斑嘴鴨的3株NDV為新城疫強(qiáng)毒。 2、斑嘴鴨源新城疫病毒融合蛋白(Fusion protein)基因的克隆及序列分析 根據(jù)Genbank上己發(fā)表的NDV F基因序列設(shè)計一對擴(kuò)增F基因的引物，用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增，并經(jīng)克隆和測序，結(jié)果獲得了野鴨源NDV7XJS061、8XJS062、L2JS063 F基因約1662bp的片段，序列分

5、析結(jié)果表明，3株野鴨源NDV F蛋白的裂解序列為<'112>R/K-R-Q-K/R-R-F<'117>，與NDV強(qiáng)毒株的特征一致。對獲得的3株野鴨源病毒F基因的序列與Genbank上發(fā)表的鵝源、雞源、鴨源等病毒的F基因的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，結(jié)果7XJS061、8XJS062、L2JS063與鵝源病毒ZJ1株之間的同源性為97.5％-97.6％，與鴨源病毒semi-muscovy duck FMl株之間的同源性為84.3％-84.4％，與雞

6、源標(biāo)準(zhǔn)弱毒株LaSota的同源性為84.5％，與雞源強(qiáng)毒株F48E9株的同源性為97.5-97.6％，與豬源swine SP13株的同源性為84.5％-84.6％，與Ch983的同源性為98.1％-98.2％。本研究表明，斑嘴鴨源NDV可能與同期或稍早期的雞源NDV流行有密切的關(guān)系。 3、斑嘴鴨源新城疫病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶基因C-末端部分片段的克隆及序列分析 根據(jù)Genbank上已發(fā)表的NDV血凝素-神經(jīng)氨酸酶基因C-