狐、貉、貂源偽狂犬病毒分離鑒定及gC基因表達.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的一種多種動物共患的烈性傳染病。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢、呼吸困難、母畜不孕、流產(chǎn)、死胎等。自2011年末疑似PR在我國遼寧、河北、山東等地的毛皮動物中大量出現(xiàn)，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。為了探尋病原學依據(jù)，從患病狐、貉、貂腦組織病料中分離到Fox1、Rac1、Mink1等多株PRV，并對其生物學特性進行了系統(tǒng)研究。

2、　　發(fā)現(xiàn)分離毒株接種MDCK細胞均呈現(xiàn)出皰疹病毒特征的細胞病變。通過電鏡，可觀察到100～180nm帶有囊膜的病毒粒子。攻毒家兔和小白鼠均表現(xiàn)出典型的PR癥狀，并從腦組織中再次檢測到PRV gB基因，證明分離病毒為PRV。進一步對Fox1、Rac1和Mink1株的生物學特性進行研究，發(fā)現(xiàn)其在MDCK細胞上的TCID50可達10-7.83/mL～10-7.5/mL，對氯仿和胰酶敏感，在pH5～pH9的環(huán)境中穩(wěn)定，對熱具有較強的耐受性。測定

3、Rac1對小鼠的LD50為10-4.8/mL。
　　通過分子流行病學分析發(fā)現(xiàn)本試驗獲得的狐、貉、貂源毒株與CLW2014-1株、TJ株、ZJ01株等近年來分離的豬源變異強毒株親緣關系最近。并且在Rac1株gE蛋白48位、497位和gC蛋白63～69位，觀察到了變異毒株特有的3處標志性插入。表明造成此次狐、貉、貂PR流行的毒株并非疫苗株或國內(nèi)早期流行毒株，而極有可能是近年來新出現(xiàn)的PRV變異株，這為我國狐、貉、貂PR的防控提供了參考

4、和依據(jù)。
　　設計特異性引物，擴增PRV Rac1株gC基因膜外區(qū)，克隆至原核表達載體pET-32a的T7啟動子下游和pGEX-6p-1的Tac啟動子下游，構建gC-His和gC-Gst重組表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達，經(jīng)Westernblot鑒定成功獲得目的蛋白，表達產(chǎn)物分子量大小分別為70kDa和76kDa。表明成功表達gC膜外區(qū)蛋白，為進一步的免疫學研究，新型診斷和治療方法的建立奠定了基礎。