貂源H9N2亞型流感病毒的分子生物學(xué)特性及其致病性研究.pdf

1、在2013年8月中旬，本實驗室從山東省中東部地區(qū)45份有呼吸道癥狀水貂的肺組織中分離到兩株H9N2亞型的流感病毒，A/mink/Shangdong/F6/2013(H9N2)(Mk/SD/F6/13)株和A/mink/Shangdong/F10/2013(H9N2)(Mk/SD/F10/13)株，并且在265份血清樣本中，53份血清樣本中抗H9N2亞型流感病毒抗體為陽性，陽性率達到20％。
　　根據(jù)Genbank中H9N2亞型流感

2、病毒的各個基因序列，分別設(shè)計擴各基因片段的特異性引物，采用RT-PCR方法擴增Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS、M各段基因，并分別將擴增產(chǎn)物克隆入T載體中進行基因組測序并對序列進行了分析。同源性分析結(jié)果，Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的八個基因片段的同源性為99.7％～100％;這兩株病毒的HA，NP和NS基因與A/chicken/Zhejiang/329/

3、2011(H9N2)毒株的相應(yīng)片段同源性最高，分別為97.9％、98.7％、98.1％;NA和PB1基因與A/duck/Hunan/S4111/2011(H9N2)毒株的相應(yīng)片段同源性最高，分別為98.2％、98.6％; PA和M基因與A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株的相應(yīng)片段同源性最高，分別為98.6％、99.4％;然而，PB2基因與A/Turkey/California/189/66(H9N2)毒

4、株的PB2基因同源性最高，為97.2％。
　　為了進一步分析兩株H9N2亞型流感病毒的基因片段的起源，用GeneBank中的H9N2亞型流感病毒的序列作為參考序列，進行系統(tǒng)發(fā)生分析。HA基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果，Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13位于歐亞系的Y280亞系分支上，并且與A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株具有最近的親緣關(guān)系;在NA的進化樹上，Mk/SD/F6/13和Mk/SD

5、/F10/13均位于歐亞系的Y280亞系分支上并且與A/duck/Hunan/S4111/2011(H9N2)具有最近的親緣關(guān)系;“內(nèi)部基因”PB1，PA，NP,M和NS的基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果，Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13均位于歐亞系的Shanghai/F/98亞系分支上且與A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株具有最近的親緣關(guān)系;PB2基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果，Mk/SD/F6/13和Mk

6、/SD/F10/13位于北美系的A/Turkey/Wisconsin/1/66的分支上。
　　為進一步揭示Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的分子特征，用DNASTAR軟件分別推導(dǎo)Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13各基因片段的氨基酸序列，并與參考毒株進行比較分析。氨基酸序列分析結(jié)果，Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的氨基酸序列同源性為100％;Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/

7、13 HA蛋白的第226位氨基酸均為亮氨酸(Leu)，具有SAα-2，6-Gal的受體結(jié)合特性;在HA蛋白的裂解位點處氨基酸序列為RSSR，表明兩株病毒均是低致病性的毒株;HA蛋白有8個潛在糖基化位點，與A/Chicken/Shanghai/F/98和A/Chicken/Beijing/1/94兩參考株相比，Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13在218位氨基酸處丟失了一個潛在的糖基化位點，在313位氨基酸處增加了一個潛在的糖

8、基化位點;Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的PB2蛋白的627位氨基酸位點為Lys，說明該兩毒株具有哺乳動物受體結(jié)合特性。
　　為了解所分離毒株對水貂的致病性，用Mk/SD/F6/13毒株作為代表毒株，建立了H9N2亞型流感病毒對水貂致病性研究的實驗動物模型，并對臨床癥狀、剖檢病理變化、排毒情況、組織病理學(xué)變化、病毒在組織器官的分布、血清抗體等各項指標(biāo)進行了檢測。在試驗期間，感染水貂表現(xiàn)出輕微呼吸道癥狀;在1～4天

9、的鼻咽拭子檢測到H9N2亞型流感病毒;感染水貂肺臟組織表現(xiàn)出血性間質(zhì)性肺炎、心臟組織表現(xiàn)心肌纖維間出血、脾臟組織出血組織病理學(xué)變化;從感染水貂的肺臟、心臟、氣管、結(jié)腸中檢測到H9N2亞型流感病毒;在感染水貂的血清中檢測到抗H9N2亞型流感病毒抗體，效價為1∶64-1∶512;實驗期間感染水貂沒有出現(xiàn)死亡。結(jié)果表明Mk/SD/F6/13毒株確實能夠感染水貂并且致病性較低。
　　本研究第一次證實了水貂能夠自然感染H9N2亞型流感病毒，