貉、狐、貂源犬瘟熱病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引發(fā)的一種急性、高度接觸性致死性傳染病?？筛腥救?、鼬科、浣熊科、大熊貓科、貓科（貓除外）等多種動(dòng)物，對(duì)我國養(yǎng)犬業(yè)和毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為此建立一種快速分離犬瘟熱病毒的可靠方法尤為重要，以此對(duì)我國毛皮動(dòng)物的犬瘟熱病毒進(jìn)行分離與生物學(xué)特性分析，為研制致弱毒株打下了基礎(chǔ)。
　　第一部分，從取皮期健康烏蘇里貉肺臟中收集巨噬細(xì)胞， ELISA實(shí)驗(yàn)篩選陽性

2、樣本，用Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)，蝕斑克隆純化病毒，獲得一株疑似犬瘟熱病毒。血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和F基因測序分析，證明該毒株確為犬瘟熱病毒，命名為CDV/R-20/12。
　　第二部分，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液獲得健康的烏蘇里貉淋巴細(xì)胞，將犬瘟熱毒株CDV/R-20/12在淋巴細(xì)胞中培養(yǎng)，培養(yǎng)5代后仍可感染Vero細(xì)胞。由此決定嘗試使用淋巴細(xì)胞進(jìn)行野毒株的分離研究，將在臨床上獲得的毛皮動(dòng)物（烏蘇里貉、狐貍、水貂）首先以RT-PCR鑒定和

3、診斷，篩選出10只CDV陽性病料，然后在獲得的淋巴細(xì)胞中分離培養(yǎng)犬瘟熱病毒。考慮到很多發(fā)病的毛皮動(dòng)物有緊急接種的可能性，采用ARMS-PCR區(qū)分是疫苗毒株和野毒株，進(jìn)行5代培養(yǎng)，分離出5株野毒株。
　　第三部分，從健康的烏蘇里貉肺臟分離到的毒株CDV/R-20/12進(jìn)行生物學(xué)特性驗(yàn)證分析。靜注、皮下、滴鼻、口服、點(diǎn)眼、肌注等方式接種毒株CDV/R-20/12是安全的，并且不能感染同居的未接種動(dòng)物。也證明了，毒株CDV/R-20/1

4、2在動(dòng)物體內(nèi)具有遺傳的穩(wěn)定性，并且能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)水平較高，結(jié)合ARMS-PCR(MuLtiplex Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction)初步證明了毒株CDV/R-20/12是CDV弱毒株。
　　第四部分，本研究將篩選出10個(gè)CDV陽性樣本的F基因進(jìn)行擴(kuò)增，并分別將其克隆到pMD18-T Vector，進(jìn)行序列測定。F基

5、因序列同源性分析:測得CDV F基因序列與Genbank上已報(bào)道的CDV毒株相比較。10個(gè)病毒株F基因序列同源性均達(dá)到97.2％以上，其中所測得毒株CDV-LNHC1和CDV-LNHC2同源性高達(dá)99.7％，氨基酸同源性為99.4％。測得序列與GenBank上的國內(nèi)外CDV F基因序列同源性在90.6％～99.3％。與Th12的同源率最高，在97.7％～99.2％之間;與毒株Shuskiy同源率最低，約為88.6％～90.2％?？傮w，1