骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與生物衍生骨復(fù)合修復(fù)山羊脛骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的 研究骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(marrowstromalcells，MSCs)與生物衍生骨復(fù)合構(gòu)建組織工程骨，修復(fù)山羊脛骨的大段骨-骨膜缺損，以探討其修復(fù)大段負(fù)重骨缺損的可行性；比較骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與生物衍生骨分別在體內(nèi)、體外復(fù)合所構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)山羊脛骨的大段骨-骨膜缺損的能力，以探討修復(fù)大段負(fù)重骨缺損最佳途徑，比較體外構(gòu)建與體內(nèi)構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)山羊脛骨大段骨-骨膜缺損的血管化進(jìn)程以及血管化與成骨的關(guān)系，了解不同組織工程骨修復(fù)長管狀

2、負(fù)重骨缺損的血管化情況，為進(jìn)一步組織工程骨的臨床實驗提供依據(jù)。 方法1.取健康成人尸體脛骨，徹底清除軟組織，切除干骺端松質(zhì)骨及皮質(zhì)骨，制成3.0×1.0×1.0cm3的柱狀骨塊，每骨塊均同時包含部分松質(zhì)骨及皮質(zhì)骨，經(jīng)脫細(xì)胞、脫脂、脫蛋白、去抗原處理后凍干制成生物衍生骨，分裝密封，用環(huán)氧乙烷消毒滅菌備用。 2.取健康山羊在無菌條件下穿刺抽取紅骨髓，梯度離心、分離；接種于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2和飽

3、和濕度條件下培養(yǎng)。待培養(yǎng)的細(xì)胞相互匯合達(dá)到90％生長面積時用0.25％胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞傳至3代時，培養(yǎng)基內(nèi)加入地塞米松、維生素、β-甘油磷酸納誘導(dǎo)3天后標(biāo)記、消化、計數(shù)備用。 3.將生物衍生骨用DMEM培養(yǎng)基浸泡1天后棄殘液，每個支架材料上按106/ml的密度接種經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞，在37℃、5％CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，從而體外構(gòu)建成組織工程骨。 4.將實驗用12月齡健康雜種青山羊麻醉后，取仰臥位，沿脛前外側(cè)作弧

4、行切口，分離脛骨，不剝離骨膜。在距脛骨結(jié)節(jié)49mm-71mm處，用線鋸鋸斷脛骨及骨膜。用8孔動力加壓鋼板螺絲釘固定，造成至少20mm的骨-骨膜缺損模型。 5.用體外構(gòu)建成的組織工程骨或單純生物衍生骨修復(fù)骨缺損，分別作為實驗組和對照組，空白組則直接逐層關(guān)閉切口。于術(shù)后2、4、6、8、12、16、24周取出骨缺損修復(fù)標(biāo)本，分別作大體觀察、組織學(xué)觀察、BrdU特異性染色、掃描電鏡觀察、X線檢查、骨密度測定結(jié)果、生物力學(xué)檢測，了解組織工

5、程骨的生物相容性及比較各組的成骨能力。 6.用體內(nèi)構(gòu)建成的組織工程骨修復(fù)骨缺損：將生物衍生骨咬成小碎塊狀，用羊膜將其包裹于鋼板和缺損區(qū)之間，兩端用絲線捆扎，注入1×106/mlMSCs懸液，作為體內(nèi)構(gòu)建組；用體外構(gòu)建成的組織工程骨、自體骨和生物衍生骨修復(fù)骨缺損，作為體外構(gòu)建組、自體骨組和單純材料組。于術(shù)后2、4、6、12、16周取出骨缺損修復(fù)標(biāo)本，分別作大體觀察、組織學(xué)觀察、BrdU特異性染色、X線檢查、骨密度測定結(jié)果、生物力學(xué)

6、檢測，了解組織工程骨的生物相容性及比較各組的成骨能力。 7.分別用體內(nèi)、外構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)骨缺損，在2、4、6、12周時間點分別用墨汁灌注后制作透明標(biāo)本，行組織學(xué)觀察和血管面積圖像分析，了解組織工程骨血管化過程及分析其與成骨的相互關(guān)系。 結(jié)果1.組織學(xué)結(jié)果顯示體外構(gòu)建的組織工程骨中早期材料孔隙內(nèi)無明顯炎性反應(yīng)，4周時，實驗組中支架材料已開始降解，未發(fā)現(xiàn)明顯的新骨形成，6周有新骨形成，8周支架材料完全降解，為編織骨所代

7、替，16周缺損區(qū)骨組織呈板層狀，有大量典型骨小梁形成，缺損區(qū)骨皮質(zhì)連續(xù)；24周缺損區(qū)為成熟板層骨，有髓腔形成，尚不典型，內(nèi)有成熟、含脂肪的黃骨髓；X片顯示8周實驗組骨痂形成明顯，12周有新骨形成，缺損區(qū)骨皮質(zhì)與骨端皮質(zhì)相連續(xù)，16周骨皮質(zhì)達(dá)到正常厚度，塑形好，髓腔部分再通，24周肉眼難以分辨缺損區(qū)，骨塑形好；骨密度結(jié)果顯示實驗組8周時的骨密度(0.962±0.076)已較對照組(6.240±0.455)高(P＜0.05)；同樣，實驗組8

8、周時的生物力學(xué)強(qiáng)度(2.27±0.61)已較對照組(1.02±0.15)高(P＜0.05)。而不論組織學(xué)觀察還是X線檢查，24周時空白組骨缺損未修復(fù)，為典型的骨不愈合的表現(xiàn)。 2.組織學(xué)結(jié)果顯示體內(nèi)、體外構(gòu)建組早期材料孔隙內(nèi)無明顯炎性反應(yīng)，材料降解較快，成骨迅速，體內(nèi)構(gòu)建組6周時羊膜已開始降解，12周已完全降解，16周時缺損區(qū)骨組織呈板層狀，有不典型骨小梁形成；X片見體外構(gòu)建組新骨形成較快，缺損區(qū)密度高，16周時已可見部分髓腔再

9、通，體內(nèi)構(gòu)建組以上各變化較前者慢大約2-4周，16周時植入物與骨斷皮質(zhì)相連續(xù)，但髓腔無再通；生物力學(xué)測試彎曲應(yīng)力在6周時，各組差異無顯著性意義(P＞0.05)，16周時體外構(gòu)建組(7.27±0.58)高于體內(nèi)構(gòu)建組(6.27±0.35)(P＜0.05)，體內(nèi)構(gòu)建組高于單純支架材料組(3.65±0.83)(P＜0.05)，體外構(gòu)建組與自體骨組(7.87±0.89)的彎曲應(yīng)力差異無顯著性意義(P＞0.05)。 3.體外構(gòu)建組與體內(nèi)構(gòu)

10、建組血管化進(jìn)程無明顯區(qū)別，術(shù)后2周，兩組均可見少量新生血管自移植物邊緣向材料內(nèi)長入，但血管數(shù)量少，走行紊亂，6周時可見血管形成明顯增多，血管排列紊亂，大量新生軟骨細(xì)胞增生，12周新生血管逐漸趨向于有序排列，材料被完全吸收，為新生骨組織所代替；各時間點血管面積差異無顯著性意義(P＞0.05)，12周均能達(dá)到完全血管化。 結(jié)論1.20mm脛骨缺損對于山羊是不能自行愈合的，符合骨缺損的要求，反映了骨缺損的一般特征。 2.同種異