長(zhǎng)期凍存后同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立可靠、純度高的犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）的分離純化方法，觀察其在體外擴(kuò)增、成骨分化的能力。并進(jìn)一步探索和評(píng)估：（1）長(zhǎng)期凍存后的BMSCs的成骨分化能力；（2）同種異體BMSCs修復(fù)顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的能力；（3）同種異體BMSCs移植是否引起明顯的免疫排斥反應(yīng)。旨在建立隨用隨取的同種異體BMSCs庫(kù)，解決骨組織工程種子細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題，促進(jìn)骨組織工程早日在臨床

2、上廣泛應(yīng)用。
　　 方法：采用1.077g/ml Ficoll分離液，密度梯度離心法分離Beagle犬骨髓得到BMSCs，體外培養(yǎng)、擴(kuò)增并用成骨條件培養(yǎng)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，進(jìn)行堿性磷酸酶、茜素紅染色和OPN、OCN、Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫熒光染色。將大量擴(kuò)增且成骨誘導(dǎo)后的BMSCs在液氮中冷凍保存6個(gè)月，復(fù)蘇后接種于β-TCP支架上共培養(yǎng)，構(gòu)建BMSCs/TCP復(fù)合物。在10只平均體重為11.9kg的成年Beagle犬顱骨上分別

3、制造左右兩個(gè)直徑為20mm的標(biāo)準(zhǔn)骨缺損，分別為實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為三組，分別為同種異體組、自體組和空白組。同種異體組接種的同種異體BMSCs來(lái)自于自體組的2只Beagle犬骨髓。自體組接種的BMSCs來(lái)自于自體組的2只Beagle犬各自本身，即為相同來(lái)源的BMSCs，其分離、純化、成骨誘導(dǎo)后凍存、復(fù)蘇、共培養(yǎng)及移植的方法在各組之間完全一致。其中6只為同種異體組，實(shí)驗(yàn)側(cè)（左）應(yīng)用成骨誘導(dǎo)后的同種異體BMSCs/β-TCP復(fù)合物修

4、復(fù)，對(duì)照側(cè)（右）單獨(dú)應(yīng)用β-TCP修復(fù)。另外2只犬（提供骨髓犬）為自體組，實(shí)驗(yàn)側(cè)（左）應(yīng)用成骨誘導(dǎo)后的自體BMSCs/β-TCP復(fù)合物修復(fù)，對(duì)照側(cè)（右）單獨(dú)應(yīng)用β-TCP修復(fù)。其余2只犬為空白組，實(shí)驗(yàn)側(cè)（左）單獨(dú)應(yīng)用β-TCP修復(fù)，對(duì)照側(cè)（右）為空白對(duì)照，不接種任何材料。
　　 應(yīng)用1-0號(hào)絲線封閉切口。采用組織學(xué)和影像學(xué)方法評(píng)估術(shù)后16和24周的修復(fù)情況。同時(shí)監(jiān)測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+的變化，對(duì)術(shù)后全身免疫反應(yīng)

5、進(jìn)行評(píng)估。
　　 結(jié)果：采用1.077g/ml Ficoll液可獲得純度較高的BMSCs，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，平均倍增時(shí)間為24h，經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后可定向分化為成骨細(xì)胞。應(yīng)用成骨誘導(dǎo)后的凍存半年的同種異體BMSCs復(fù)合β-TCP修復(fù)Beagle犬顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損，無(wú)明顯不良反應(yīng)，所有動(dòng)物術(shù)后均存活，無(wú)感染發(fā)生。16周后初步的組織學(xué)和影像學(xué)檢查表明，同種異體組（6例）的成骨情況良好。免疫學(xué)分析表明CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量以及CD4+/