骨髓間充質干細胞復合β-TCP生物陶瓷修復山羊骨軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、背景: 目前臨床上較為成熟的軟骨修復技術包括骨髓刺激和移植兩大類：前者如軟骨下鉆孔術和微骨折技術；后者有自體骨軟骨鑲嵌成型術（Mosaicplasty）和自體軟骨細胞移植（ACI）術。但上述技術本身均有其各自的局限性。 磷酸鈣生物陶瓷作為一種優(yōu)秀的骨組織工程支架材料已被廣泛接受，其中應用最多的是羥基磷灰石（HA）和β-磷酸三鈣（β-TCP）。β-TCP具有良好生物相容性和降解性、骨傳導能力佳、機械強度適中、微結構和體內降

2、解速率可操控等優(yōu)點。磷酸鈣生物陶瓷在被用作骨支架材料的同時，也已被用于組織工程軟骨的構建，已有學者使用β-TCP復合軟骨細胞或成軟骨誘導的干細胞成功地進行了軟骨構建。 本研究以山羊BMSCs作為種子細胞，β-TCP生物陶瓷作為組織工程骨及軟骨的構建材料。首先進行山羊BMSCs的成骨成軟骨方面的誘導，以鑒定其多向誘導分化的能力；進而采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標記山羊BMSCs，研究其對山羊BMSCs標記的可行性及其最佳標

3、記濃度和時間，以及對標記對細胞的增殖的影響，為確認下一步山羊體內實驗形成的新生軟骨組織來源提供研究基礎；最后，利用負壓抽吸的方法，使山羊BMSCs結合于β-TCP生物陶瓷，設計并制作雙腔生物反應器，在其中分別進行成骨誘導分化和成軟骨誘導分化；并制作山羊膝關節(jié)骨軟骨缺損，將在雙腔生物反應器中分別誘導2周的β-TCP-細胞復合物移植于山羊膝關節(jié)骨軟骨缺損部位，觀察其對骨軟骨缺損的治療效果，為臨床利用自體BMSCs進行組織工程修復骨軟骨缺損提

4、供尋找一種新的方法。 材料與方法: 1.山羊BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定及向成骨細胞、成軟骨細胞誘導分化 抽取10月齡健康中國青山羊骨髓，全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs，體外培養(yǎng)至第4代（P4）時行流式細胞術鑒定，并加入成骨誘導培養(yǎng)基和成軟骨誘導培養(yǎng)基。成骨誘導培養(yǎng)基成分為：終濃度為100nmol/l地塞米松、10mmol/1β-磷酸甘油、50ug/ml抗壞血酸的10%FBS高糖DMEM；成軟骨誘導培養(yǎng)基成分：終濃度

5、為6.25μg/ml胰島素、6.25μg/ml轉鐵蛋白、50ug/ml抗壞血酸、100nmol/L地塞米松及10 ng/ml TGF-β1的10%FBS高糖DMEM。誘導兩周后分別行細胞化學染色、免疫細胞化學染色，并采用逆轉錄，聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白印跡試驗（Western blot）檢測0、1、2、4周的I型膠原、Ⅱ型膠原和Aggrecan的表達。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，結果用x±s表示，p值<0.05為有統(tǒng)計

6、學差異。第4代和第8代的細胞倍增時間的比較，采用兩獨立樣本t檢驗；各時間點mRNA和蛋白的相對表達量的比較，應用多個樣本均數(shù)比較的方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用LSD法。 2、BrdU體外標記山羊骨髓間充質干細胞的研究。 利用BrdU標記山羊BMSCs，檢測其最佳標記時間、標記劑量及毒性作用，探討其作為山羊BMSCs標記示蹤方法的可行性。培養(yǎng)山羊BMSCs，取第4代細胞以濃度分別為5、10、15

7、和20μmol/L的BrdU進行標記，分別記為A、B、C、D組；另1孔不含BrdU，作為空白對照（E組）。分別標記12、24、48和72h后，采用免疫熒光法檢測各組細胞陽性率，并用苔盼藍拒染法測定標記后細胞活率。并觀察山羊BMSCs標記后向骨和軟骨細胞的分化；使用MTT法檢測標記后細胞的增殖能力。細胞陽性標記率和標記前后存活率的均值比較采用析因設計資料的方差分析；細胞標記前、后的細胞倍增時間的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，以P<0.05為

8、有顯著性差異。 3、雙腔攪拌式生物反應器的制作及組織工程骨軟骨修復山羊膝關節(jié)缺損的體內研究。 制作雙腔攪拌式生物反應器。取第4代山羊BMSCs，以5×107/ml的細胞密度與β-TCP生物陶瓷相復合。在雙腔生物反應器中誘導2周后，將BMSCs-β-TCP生物陶瓷復合物植入山羊膝關節(jié)缺損區(qū)域內。于山羊的雙后肢股骨內髁負重區(qū)制造直徑6mm和深度12mm的缺損，使用外徑為6mm的環(huán)鋸，在負重位置的軟骨上鉆孔，取出骨和軟骨碎屑后

9、，壓配方式植入直徑6mm，長度12mm的BMSCs-β-TCP生物陶瓷復合物，缺損區(qū)域表面用復合山羊BMSCs的1.2%藻酸鈉與102mM氯化鈣交聯(lián)形成的凝膠覆蓋。根據植入物在生物反應器中是否經力學刺激，將山羊分為三組：A組：力學刺激+雙向誘導組；B組：單純雙向誘導組；C組：空白對照組。每組山羊各4只，共12只24個膝關節(jié)。術后圈養(yǎng)，不限活動，于術后12周、24周分別處死各組2只山羊。進行如下項目檢測：大體觀察；組織學及組織化學檢測：H

10、E染色；甲苯胺藍染色；Masson染色，Ⅱ型膠原免疫組化，并觀察Brdu的表達。進行O'Driscoll，Keeley and Salter組織形態(tài)學評分。評分后的數(shù)據以x±s表示，應用兩因素方差分析，組間比較用LSD法，以P<0.05為有顯著性差異。 結果： 1.原代培養(yǎng)的山羊BMSCs形態(tài)呈紡錘狀或梭狀，折光性好，貼壁生長，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞呈集落狀生長，集落中細胞形態(tài)為典型的梭形細胞，并逐漸融合成片。培養(yǎng)7～8

11、d約80%融合，9～10d可形成90%融合的細胞單層。傳代細胞大部分為長梭形，細胞生長速度較原代細胞明顯增快，潛伏期為2～3d后開始進入對數(shù)生長期，7～8d進入平臺期。流式細胞術檢測細胞表面抗原，可見表達BMSCs標志物CD29，而不表達傳代造血干細胞標志物CD34。在成骨細胞誘導分化培養(yǎng)基、成軟骨細胞誘導分化培養(yǎng)基的作用下，能分化出成熟的成骨細胞和軟骨細胞；2周后分別行成骨細胞鑒定可見堿性磷酸酶染色、茜素紅染色呈陽性，行成軟骨細胞鑒定

12、可見甲苯胺藍和阿利新藍染色陽性。RT-PCR、Western blot及免疫細胞染色結果均證實其向成骨和成軟骨細胞的分化。第4代和第8代細胞的形態(tài)及生長增殖狀況無明顯差別（t=0.342，p=0.741），并且，在成骨及成軟骨誘導2周時，Collagen Ⅰ、Ⅱ和Aggrecan mRNA和蛋白的表達量與誘導后4周無統(tǒng)計學差異（p>0.05），與未誘導組及誘導1周組有統(tǒng)計學差異（p<0.05）。 2.第4代山羊BMSCs經Brd

13、U標記后行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下胞核呈綠色熒光。隨著標記時間的延長和BrdU劑量的增加，標記率逐漸增高，BrdU終濃度為15μmol/L且標記48h后細胞標記率>90%，但標記時間繼續(xù)延長和BrdU濃度繼續(xù)增加，細胞標記率無明顯增高，表明BrdU標記山羊BMSCs的最佳濃度為15 μmol/L，最佳標記時間為48h。與正常未標記細胞比較，標記后細胞的形態(tài)及生長增殖狀況無明顯差別（t=0.178，p=0.862），活細胞數(shù)>98%。

14、15μmol/LBrdU標記山羊BMSCs48h后不影響向成骨和成軟骨細胞分化的能力。 3.術后12周取材，A組修復區(qū)可見部分軟骨樣組織，關節(jié)軟骨無磨損，修復的軟骨呈白色半透明外觀，與周圍正常關節(jié)軟骨有連續(xù)性，可見一明顯的凹陷，無明顯軟骨下骨外露；B組修復區(qū)也可見部分軟骨樣組織，關節(jié)軟骨在修復區(qū)可見磨損，軟骨呈白色不透明外觀，軟骨下骨形成較好；空白對照組術區(qū)關節(jié)凹陷，無關節(jié)軟骨組織形成，關節(jié)下骨缺如。BrdU免疫熒光證實，新生軟

15、骨中部分細胞來源于植入的山羊自體BMSCs。組織學檢查示，β-TCP生物陶瓷已基本吸收降解。術后24周取材，見A組山羊手術區(qū)關節(jié)表面較為光滑，與周邊正常軟骨自然連續(xù)平齊，透明的新生軟骨組織形成，軟骨下骨形成完好；B組山羊手術區(qū)修復的軟骨組織基本完整，中心部位仍未完全融合，有微小凹陷；Ⅱ型膠原免疫組化示新生軟骨組織呈棕黃色。C組術區(qū)關節(jié)凹陷，無關節(jié)軟骨組織形成。A組和B組，軟骨下骨的生長及與周圍組織的結合均較好，無植入物脫落現(xiàn)象的發(fā)生。

16、 組織學檢測結果顯示：A組在山羊體內形成的軟骨質量優(yōu)于B組，O'Driscoll Keeley and Salter組織形態(tài)學評分為：A組12周（n=4）16.00±0.816，24周（n=4）18.75±0.957；B組（n=4）12周11.00±0.816，24周（n=4）14.75±0.957；C組未形成軟骨，12周及24周時各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論： 1、髂骨骨髓穿刺可分離出BMS

17、Cs。全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)的BMSCs生長至第4代時，純度較高，活力旺盛。本實驗證明，山羊BMSCs具有向成骨細胞和軟骨細胞分化的潛能，并且其在成骨和成軟骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周時，其可表達成骨和成軟骨的標志。山羊BMSCs來源豐富、取材容易，創(chuàng)傷小，是理想的組織工程種子細胞，具有廣闊的應用前景。 2、BrdU標記山羊BMSCs的最佳時間為48小時；最佳終濃度為15μmol/L；標記陽性率>90%。BrdU對細胞無毒副作用，安全性高，