基于天然鈣化軟骨層研制仿生型組織工程骨軟骨支架.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)傷及骨病所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷在臨床工作中十分常見(jiàn),目前臨床修復(fù)軟骨損傷的方法很多,但都有不同程度的局限性,廣為應(yīng)用的以微骨折術(shù)為代表的骨膜刺激術(shù)通過(guò)破壞鈣化軟骨層結(jié)構(gòu),使位于軟骨下骨骨髓內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞伴隨著血液移行至軟骨缺損區(qū),形成血凝塊,而干細(xì)胞在其中增殖分化形成纖維軟骨。然而纖維軟骨的生物學(xué)特性及機(jī)械性能與透明軟骨存在顯著差異,長(zhǎng)期療效欠佳。而軟骨移植技術(shù)被認(rèn)為是拆東墻補(bǔ)西墻的手術(shù)方法,易造成供體區(qū)病損,且

2、因供區(qū)有限,大塊軟骨缺損難以應(yīng)用此法。異體軟骨移植同樣存在著供體獲得困難、易造成疾病傳播及免疫排斥反應(yīng)等劣勢(shì)。軟骨細(xì)胞移植技術(shù)由于細(xì)胞獲取困難、病人經(jīng)歷二次手術(shù)及供體部位軟骨損害等因素,通常難以令人滿意。
　　以再生醫(yī)學(xué)為主要代表的組織工程技術(shù)為治療關(guān)節(jié)骨軟骨損傷提供新途徑和希望,作為其核心內(nèi)容之一的支架材料在組織工程再生修復(fù)中起重要作用。目前應(yīng)用于組織工程的生物材料及人工材料較為廣泛,其中組織工程骨軟骨支架因雙側(cè)不同的材料需求,

3、所以其制備支架的標(biāo)準(zhǔn)要求較高,制備方式主要包括分層構(gòu)建和一體化構(gòu)建兩種形式,分層構(gòu)建即分別構(gòu)建軟骨和骨支架,用纖維蛋白膠粘合或可吸收材料縫合成一個(gè)整體,經(jīng)體外培養(yǎng)或直接植入體內(nèi)修復(fù)缺損;一體化構(gòu)建即前期制備骨和軟骨復(fù)合支架,然后分別接種成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞,體外培養(yǎng)后植入骨軟骨缺損處。研究表明工程化組織存在力學(xué)性能低下、纖維軟骨樣退變、與宿主組織整合欠佳等缺點(diǎn),難以確保關(guān)節(jié)骨軟骨損傷再生修復(fù)的長(zhǎng)期有效性。
　　依據(jù)組織工程學(xué)最基本原

4、理及骨軟骨組織工程技術(shù)最新進(jìn)展,認(rèn)為導(dǎo)致上述問(wèn)題的主要原因?yàn)?
　?、賹?duì)關(guān)節(jié)骨軟骨組織獨(dú)特的生化成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)及其力學(xué)與生物學(xué)功能缺乏深入認(rèn)識(shí);
　?、诂F(xiàn)有策略構(gòu)建的工程化骨軟骨在結(jié)構(gòu)與功能上存在明顯缺陷,尤其是缺少透明軟骨與軟骨下骨之間的界面連接結(jié)構(gòu)---鈣化軟骨層;其中,缺乏對(duì)關(guān)節(jié)骨軟骨界面連接結(jié)構(gòu)的深入認(rèn)識(shí)與仿生構(gòu)建理念是其最重要的原因和限制這一技術(shù)臨床應(yīng)用的瓶頸。
　　據(jù)此,在深入認(rèn)識(shí)關(guān)節(jié)骨軟骨鈣化軟骨層的形態(tài)

5、結(jié)構(gòu)與理化功能的基礎(chǔ)上,根據(jù)工程化“透明軟骨—鈣化軟骨層—軟骨下骨”一體化構(gòu)建新理念,我們選用脫細(xì)胞和復(fù)合膠原凍干交聯(lián)的方法設(shè)計(jì)制造具有“鈣化層結(jié)構(gòu)”的天然骨軟骨支架。以Ⅱ型膠原凝膠構(gòu)建軟骨部分,保留天然鈣化層結(jié)構(gòu)的骨塊經(jīng)脫細(xì)胞處理后構(gòu)建骨部分。將二者復(fù)合凍干、交聯(lián),保留了骨軟骨天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分,因而生物相容性佳;支架分別采用骨和軟骨組織中的的細(xì)胞外基質(zhì)成分為原料進(jìn)行構(gòu)建,適合兩種組織不同的生長(zhǎng)需求;本研究保留天然鈣化層結(jié)構(gòu),更符合

6、骨軟骨生理特征,因此可能成為骨軟骨組織工程的理想支架。本課題闡明了“鈣化軟骨層”結(jié)構(gòu)在骨軟骨復(fù)合組織中構(gòu)建的可行性,為應(yīng)用新理念再生修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
　　方法:
　　1.保留天然鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)脫細(xì)胞骨的制備及鑒定:鉆取直徑8mm的含有天然鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)的骨柱,盡可能切除上層軟骨而確保不傷及鈣化層結(jié)構(gòu)。對(duì)骨柱進(jìn)行脫細(xì)胞處理,然后進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)脫細(xì)胞情況及脫細(xì)胞過(guò)程對(duì)鈣化層的影響。
　　2.Ⅱ型膠

7、原蛋白的制備及鑒定:取新鮮豬膝關(guān)節(jié),分離各關(guān)節(jié)面,削取軟骨片,凍干、粉碎、消化制備Ⅱ型膠原蛋白。檢測(cè)其提取率、分子量、純度等指標(biāo)。
　　3.復(fù)合骨軟骨支架的研制及鑒定:將脫細(xì)胞骨塊放入模具上方接種2mm厚的Ⅱ型膠原蛋白,凍干、交聯(lián)制備骨軟骨支架,掃描電鏡及無(wú)水乙醇置換法對(duì)支架結(jié)構(gòu)孔徑孔隙進(jìn)行測(cè)量。以無(wú)鈣化層的骨軟骨支架為對(duì)照組,接種 BMSCs觀察其細(xì)胞相容性。慢病毒eGFP轉(zhuǎn)染BMSCs接種支架,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　4

8、.使用SigmaPlot12.0進(jìn)行繪圖制表,SPSS18.0對(duì)骨軟骨支架的孔徑孔隙率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)值以x±s表示。
　　結(jié)果:
　　1.保留天然鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)脫細(xì)胞骨的制備及鑒定:含有鈣化軟骨層骨支架脫細(xì)胞效果良好,組織學(xué)觀察細(xì)胞清除徹底,組織學(xué)觀察結(jié)合 Micro-CT可見(jiàn)鈣化軟骨層與軟骨下骨結(jié)構(gòu)與正常骨軟骨比較完整無(wú)破壞。
　　2.Ⅱ型膠原蛋白的制備及鑒定:制備的Ⅱ型膠原蛋白呈乳白色凝膠狀,Ⅱ型膠原蛋白提取率為

9、3.9％,SDS-PAGE監(jiān)測(cè)結(jié)果提示分子量略大于130KD,無(wú)雜帶。高效液相色譜與Sigma公司生產(chǎn)的Ⅱ型膠原蛋白對(duì)比主峰出現(xiàn)部位基本相同。
　　3.復(fù)合骨軟骨支架的研制及鑒定:實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組支架制備完成,骨軟骨連接良好,支架具有良好的孔徑孔隙率,軟骨部分的Ⅱ型膠原海綿支架的孔隙率為(91.1±3.8)%,其孔徑大小為(79.7±17.1)μm;脫細(xì)胞骨支架的孔隙率為(73.5±2.6)%,其孔徑大小為(470.2±158.8)