轉(zhuǎn)基因組織工程軟骨修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損.pdf

1、一研究背景及目的由創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎等引起的關(guān)節(jié)軟骨病損是骨科常見疾患，已成為導(dǎo)致中老年人殘疾的主要原因。局限于軟骨淺層的缺損，依靠軟骨細(xì)胞有限的分裂能力僅有微小的內(nèi)源性修復(fù)或難以修復(fù)；全層關(guān)節(jié)軟骨缺損，由骨髓遷徙來的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，形成的新生修復(fù)組織介于纖維軟骨和透明軟骨之間，其性能難與正常軟骨相比，逐漸出現(xiàn)退變。近年來探索應(yīng)用于臨床的許多方法，如鉆孔術(shù)、關(guān)節(jié)鏡下磨削及灌洗術(shù)、自體或異體組織(骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊等)移植、細(xì)

2、胞(軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞)移植等，雖在近期能獲得癥狀的改善，但未能使受損的軟骨在形態(tài)學(xué)、生化和生物力學(xué)方面恢復(fù)至正常，修復(fù)組織不能達(dá)到良好的遠(yuǎn)期療效，常在短期內(nèi)發(fā)生退變。諸多嘗試說明在接受關(guān)節(jié)置換之前尚無(wú)公認(rèn)的有效手段。組織工程技術(shù)可以通過獲取自體或異體少量組織細(xì)胞，在某些細(xì)胞因子的作用下，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后與支架材料復(fù)合，構(gòu)建與病損區(qū)形狀結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性相近的細(xì)胞—支架復(fù)合體，以修復(fù)或替代損傷組織。以自體軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，存在來源有

3、限，體外多次傳代培養(yǎng)易使細(xì)胞發(fā)生“去分化”，喪失分泌軟骨基質(zhì)的能力，因此難以用少量自體組織經(jīng)培養(yǎng)獲得大量有正常功能的軟骨細(xì)胞。干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的分裂增殖能力及多向分化潛能，在一定條件下可以分化為軟骨細(xì)胞，但體外培養(yǎng)條件下如何誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞表型分化，以及如何維持軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定等目前尚未明確。同種異體軟骨細(xì)胞具有來源廣泛，可以一次性獲取大量細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，在三維立體培養(yǎng)環(huán)境下可保持軟骨細(xì)胞分化特性，根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)

4、證實(shí)異體軟骨細(xì)胞移植不發(fā)生嚴(yán)重免疫排斥反應(yīng)，顯示同種異體軟骨細(xì)胞可以作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。 理想的支架對(duì)于成功構(gòu)建組織工程軟骨也至關(guān)重要。天然材料具有良好的細(xì)胞和組織相容性，但因初始機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度不足現(xiàn)已較少使用，人工材料具有易加工、降解速率可調(diào)節(jié)、力學(xué)性能好、來源穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但是一般人工合成的可降解材料具有較強(qiáng)疏水性的表面，而且其表面缺乏細(xì)胞可以識(shí)別的位點(diǎn)，因而普遍不具有良好的細(xì)胞相容性。將天然材料與人工材料以一定的方式結(jié)

5、合起來，制成合成的多孔支架，以使兩者的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，可望制得較理想的軟骨組織工程支架。 為成功構(gòu)建工程軟骨，需要促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖、維持細(xì)胞的表型、增進(jìn)胞外基質(zhì)的合成，已證實(shí)有多種細(xì)胞因子如TGF-β、bFGF、IGF、HGF等能促進(jìn)軟骨形成或刺激細(xì)胞增殖。近年來BMP7被發(fā)現(xiàn)能維持軟骨細(xì)胞的表型，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)如蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成，并抑制由白介素-1(interleukin-1，IL-1)介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)分解代謝。BMP

6、7還能使體外培養(yǎng)中已經(jīng)表現(xiàn)反分化的軟骨細(xì)胞恢復(fù)表型，重新表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性物質(zhì)。但外源性BMP7來源有限、半衰期短，易被創(chuàng)傷局部的蛋白酶所水解，且治療劑量相對(duì)較大，有可能導(dǎo)致毒性作用的產(chǎn)生限制了其應(yīng)用。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將BMP7因子的cDNA轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，可使之在體內(nèi)一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)內(nèi)源性BMP7，以維持軟骨細(xì)胞的成軟骨生物學(xué)性狀。 本實(shí)驗(yàn)研究擬選用幼兔的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，在體外不同培養(yǎng)條件下觀察軟骨細(xì)胞的生物學(xué)性狀變化；

7、通過構(gòu)建攜帶重組人BMP7cDNA的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞；同時(shí)采用Ⅰ型膠原和羥基磷灰石復(fù)合，構(gòu)建柱狀分層的支架；將軟骨細(xì)胞種植其中培養(yǎng)，構(gòu)建小型組織工程軟骨復(fù)合體，觀察植入動(dòng)物體內(nèi)修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的轉(zhuǎn)歸。 二實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果第一部分不同培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化方法：Ⅰ型膠原支架通過以下步驟制作：將EDC按比例加入Ⅰ型膠原溶液中混合，倒入制作好的模具內(nèi)，4℃靜置24h，-80℃冷凍1h后脫模，再在冷凍干

8、燥機(jī)中處理12h，得到Ⅰ型膠原支架。應(yīng)用序列酶消化法自2周齡新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中分離軟骨細(xì)胞，單層培養(yǎng)擴(kuò)增。通過細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA周期，透射電鏡檢測(cè)，以及Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞在體外單層培養(yǎng)條件下的生物學(xué)性狀變化；將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代細(xì)胞消化離心，接種于Ⅰ型膠原支架三維立體培養(yǎng)3周，經(jīng)相差倒置顯微鏡、掃描電鏡、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)軟骨細(xì)胞在膠原支架中三維立體培養(yǎng)條件下的生物學(xué)

9、性狀變化。 結(jié)果：體外單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞呈三角或多角形，胞核大而圓，3代以前增殖速度快。隨著傳代次數(shù)的增加，增殖速度減慢，傳6代以后，細(xì)胞分裂能力明顯下降，細(xì)胞變形明顯，體積變大，表現(xiàn)出細(xì)胞老化和向成纖維細(xì)胞反分化的趨勢(shì)。第2代細(xì)胞Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色胞漿內(nèi)呈陽(yáng)性反應(yīng)，至第6代細(xì)胞Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色陰性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示第2代細(xì)胞處于S/G2M期細(xì)胞的比例比第6代細(xì)胞明顯高，說明傳代6代后細(xì)胞分裂增殖

10、明顯減慢。透射電鏡檢查第3代細(xì)胞核仁大，染色質(zhì)豐富，細(xì)胞內(nèi)可見大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體，第6代細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。軟骨細(xì)胞在Ⅰ型膠原支架表面呈長(zhǎng)梭形，在支架內(nèi)部細(xì)胞聚集成團(tuán)，呈圓形或卵圓形，細(xì)胞團(tuán)中有基質(zhì)分泌，沉積于細(xì)胞周圍，部分區(qū)域形成類似于軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，Ⅱ型膠原免疫組化染色示胞漿內(nèi)陽(yáng)性反應(yīng)。掃描電鏡觀察可見細(xì)胞成團(tuán)地吸附于支架表面及孔隙側(cè)壁，并可見細(xì)胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上。 第二部分重組人BMP7

11、質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后的表達(dá)方法：構(gòu)建重組人BMP7真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-rhBMP7，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。在轉(zhuǎn)染試劑Effectene的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中加入G418篩選，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后的瞬時(shí)表達(dá)，采用G418篩選和免疫組化染色檢測(cè)BMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后的穩(wěn)定表達(dá)。MTT法和S-100免疫組化檢測(cè)BMP7基因轉(zhuǎn)染對(duì)軟骨細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。結(jié)果：構(gòu)建的真

12、核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-rhBMP7經(jīng)酶切PCR及DNA測(cè)序證實(shí)。pcDNA3.1-BMP7轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞經(jīng)G418篩選，未得到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞逐漸凋亡，轉(zhuǎn)染細(xì)胞長(zhǎng)成細(xì)胞克隆，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，擴(kuò)增得到了相應(yīng)的DNA片段，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則明顯表達(dá)較弱，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BMP7基因拷貝數(shù)在轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞之間有顯著差異，證明rhBMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后其BMP7表達(dá)水平有明顯變化。MTT法檢測(cè)證實(shí)rhBMP7基因轉(zhuǎn)

13、染軟骨細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，S-100免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，未轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞為陰性。 第三部分Ⅰ型膠原/羥基磷灰石柱狀分層支架的構(gòu)建及與軟骨細(xì)胞的體外相容性觀察 方法：Ⅰ型膠原/HA分層支架按以下步驟制備：將Ⅰ型膠原溶液加入分散的HA溶液中攪拌混合，加入EDC。調(diào)配形成不同比例的膠原-HA復(fù)合物，逐層加入模具，4℃靜置24h，放入-80℃過夜，再在冷凍干燥機(jī)中干燥12h后取出即可。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好

14、的第2、3代軟骨細(xì)胞消化離心，接種于Ⅰ型膠原/HA支架，經(jīng)相差倒置顯微鏡、掃描電鏡、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)軟骨細(xì)胞與支架的相容性。 結(jié)果：Ⅰ型膠原/HA為具有一定機(jī)械強(qiáng)度的柱狀分層的三維多孔支架，最上層為純膠原，底層為純HA，中間為膠原與HA復(fù)合。掃描電鏡觀察，支架表面為純膠原，具有不規(guī)則的通孔結(jié)構(gòu)，孔徑較均勻且相互連通，中間層為多孔的Ⅰ型膠原/HA復(fù)合。支架表面細(xì)胞數(shù)量較多，多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，支架內(nèi)部細(xì)胞聚集成團(tuán)，呈圓形或卵圓形

15、，細(xì)胞團(tuán)中有基質(zhì)分泌，沉積于細(xì)胞周圍，部分區(qū)域形成類似于軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，靠近支架底部細(xì)胞很少。Ⅱ型膠原免疫組化染色示胞漿內(nèi)陽(yáng)性反應(yīng)。掃描電鏡觀察可見細(xì)胞成團(tuán)地吸附于支架表面及孔隙側(cè)壁，并可見細(xì)胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上。 第四部分轉(zhuǎn)基因組織工程軟骨移植修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損方法：體外分離培養(yǎng)2周齡新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，部分細(xì)胞進(jìn)行重組人BMP7基因轉(zhuǎn)染，將兩種細(xì)胞分別種植于Ⅰ型膠原/HA支架構(gòu)建工程

16、軟骨復(fù)合體。在30只兔膝關(guān)節(jié)股骨髁或股骨滑車作一直徑3.5mm、深約3-4mm的軟骨缺損。分4組處理，即缺損曠置、單純支架植入、軟骨細(xì)胞+支架復(fù)合體植入、rhBMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞+支架復(fù)合體植入，分別于術(shù)后4、8、12、16周取材，進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)檢查和病理評(píng)分。 結(jié)論通過本實(shí)驗(yàn)研究，得出以下結(jié)論：1.軟骨細(xì)胞在體外單層培養(yǎng)會(huì)發(fā)生去分化現(xiàn)象，失去細(xì)胞表型，高密度培養(yǎng)能減緩該過程，在Ⅰ型膠原支架中三維立體培養(yǎng)有利

17、于維持其細(xì)胞表型及功能。2.外源性重組人BMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞可以獲得高效表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有一定的維持軟骨細(xì)胞表型及促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用，為軟骨組織工程的研究提供了改良的種子細(xì)胞。 3.具有柱狀分層結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原/羥基磷灰石復(fù)合支架與軟骨細(xì)胞相容性良好，具有比膠原更強(qiáng)的力學(xué)性能，是比較理想的軟骨組織工程支架材料，但羥基磷灰石在體內(nèi)降解緩慢，誘導(dǎo)成骨以重建軟骨下骨的性能也不夠理想是主要缺陷。 4.同種異體軟骨細(xì)胞移植