轉基因組織工程軟骨修復兔膝關節(jié)軟骨全層缺損.pdf

1、一研究背景及目的由創(chuàng)傷、骨關節(jié)炎等引起的關節(jié)軟骨病損是骨科常見疾患，已成為導致中老年人殘疾的主要原因。局限于軟骨淺層的缺損，依靠軟骨細胞有限的分裂能力僅有微小的內源性修復或難以修復；全層關節(jié)軟骨缺損，由骨髓遷徙來的間充質干細胞分化為軟骨細胞，形成的新生修復組織介于纖維軟骨和透明軟骨之間，其性能難與正常軟骨相比，逐漸出現(xiàn)退變。近年來探索應用于臨床的許多方法，如鉆孔術、關節(jié)鏡下磨削及灌洗術、自體或異體組織(骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊等)移植、細

2、胞(軟骨細胞或間充質干細胞)移植等，雖在近期能獲得癥狀的改善，但未能使受損的軟骨在形態(tài)學、生化和生物力學方面恢復至正常，修復組織不能達到良好的遠期療效，常在短期內發(fā)生退變。諸多嘗試說明在接受關節(jié)置換之前尚無公認的有效手段。組織工程技術可以通過獲取自體或異體少量組織細胞，在某些細胞因子的作用下，經體外培養(yǎng)擴增后與支架材料復合，構建與病損區(qū)形狀結構、生物學特性相近的細胞—支架復合體，以修復或替代損傷組織。以自體軟骨細胞為種子細胞，存在來源有

3、限，體外多次傳代培養(yǎng)易使細胞發(fā)生“去分化”，喪失分泌軟骨基質的能力，因此難以用少量自體組織經培養(yǎng)獲得大量有正常功能的軟骨細胞。干細胞如胚胎干細胞和骨髓基質干細胞具有很強的分裂增殖能力及多向分化潛能，在一定條件下可以分化為軟骨細胞，但體外培養(yǎng)條件下如何誘導干細胞向軟骨細胞表型分化，以及如何維持軟骨細胞表型穩(wěn)定等目前尚未明確。同種異體軟骨細胞具有來源廣泛，可以一次性獲取大量細胞等優(yōu)點，在三維立體培養(yǎng)環(huán)境下可保持軟骨細胞分化特性，根據以往實驗

4、證實異體軟骨細胞移植不發(fā)生嚴重免疫排斥反應，顯示同種異體軟骨細胞可以作為軟骨組織工程的種子細胞。 理想的支架對于成功構建組織工程軟骨也至關重要。天然材料具有良好的細胞和組織相容性，但因初始機械力學強度不足現(xiàn)已較少使用，人工材料具有易加工、降解速率可調節(jié)、力學性能好、來源穩(wěn)定等優(yōu)點，但是一般人工合成的可降解材料具有較強疏水性的表面，而且其表面缺乏細胞可以識別的位點，因而普遍不具有良好的細胞相容性。將天然材料與人工材料以一定的方式結

5、合起來，制成合成的多孔支架，以使兩者的優(yōu)點相結合，可望制得較理想的軟骨組織工程支架。 為成功構建工程軟骨，需要促進軟骨細胞的增殖、維持細胞的表型、增進胞外基質的合成，已證實有多種細胞因子如TGF-β、bFGF、IGF、HGF等能促進軟骨形成或刺激細胞增殖。近年來BMP7被發(fā)現(xiàn)能維持軟骨細胞的表型，誘導軟骨細胞外基質如蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成，并抑制由白介素-1(interleukin-1，IL-1)介導的軟骨基質分解代謝。BMP

6、7還能使體外培養(yǎng)中已經表現(xiàn)反分化的軟骨細胞恢復表型，重新表達軟骨細胞特異性物質。但外源性BMP7來源有限、半衰期短，易被創(chuàng)傷局部的蛋白酶所水解，且治療劑量相對較大，有可能導致毒性作用的產生限制了其應用。采用轉基因技術將BMP7因子的cDNA轉染軟骨細胞，可使之在體內一定時間內持續(xù)表達內源性BMP7，以維持軟骨細胞的成軟骨生物學性狀。 本實驗研究擬選用幼兔的關節(jié)軟骨細胞為種子細胞，在體外不同培養(yǎng)條件下觀察軟骨細胞的生物學性狀變化；

7、通過構建攜帶重組人BMP7cDNA的質粒DNA，轉染體外培養(yǎng)擴增的軟骨細胞；同時采用Ⅰ型膠原和羥基磷灰石復合，構建柱狀分層的支架；將軟骨細胞種植其中培養(yǎng)，構建小型組織工程軟骨復合體，觀察植入動物體內修復膝關節(jié)軟骨缺損的轉歸。 二實驗方法與結果第一部分不同培養(yǎng)條件下軟骨細胞生物學性狀的變化方法：Ⅰ型膠原支架通過以下步驟制作：將EDC按比例加入Ⅰ型膠原溶液中混合，倒入制作好的模具內，4℃靜置24h，-80℃冷凍1h后脫模，再在冷凍干

8、燥機中處理12h，得到Ⅰ型膠原支架。應用序列酶消化法自2周齡新西蘭大白兔膝關節(jié)軟骨組織中分離軟骨細胞，單層培養(yǎng)擴增。通過細胞生長曲線的測定，流式細胞儀檢測細胞DNA周期，透射電鏡檢測，以及Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色檢測軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)條件下的生物學性狀變化；將生長狀態(tài)良好的第2代細胞消化離心，接種于Ⅰ型膠原支架三維立體培養(yǎng)3周，經相差倒置顯微鏡、掃描電鏡、組織學和免疫組織化學檢測軟骨細胞在膠原支架中三維立體培養(yǎng)條件下的生物學

9、性狀變化。 結果：體外單層培養(yǎng)的軟骨細胞呈三角或多角形，胞核大而圓，3代以前增殖速度快。隨著傳代次數的增加，增殖速度減慢，傳6代以后，細胞分裂能力明顯下降，細胞變形明顯，體積變大，表現(xiàn)出細胞老化和向成纖維細胞反分化的趨勢。第2代細胞Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色胞漿內呈陽性反應，至第6代細胞Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色陰性。流式細胞儀檢測顯示第2代細胞處于S/G2M期細胞的比例比第6代細胞明顯高，說明傳代6代后細胞分裂增殖

10、明顯減慢。透射電鏡檢查第3代細胞核仁大，染色質豐富，細胞內可見大量的粗面內質網、線粒體，第6代細胞出現(xiàn)空泡變性。軟骨細胞在Ⅰ型膠原支架表面呈長梭形，在支架內部細胞聚集成團，呈圓形或卵圓形，細胞團中有基質分泌，沉積于細胞周圍，部分區(qū)域形成類似于軟骨陷窩樣結構，Ⅱ型膠原免疫組化染色示胞漿內陽性反應。掃描電鏡觀察可見細胞成團地吸附于支架表面及孔隙側壁，并可見細胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上。 第二部分重組人BMP7

11、質粒的構建及轉染軟骨細胞后的表達方法：構建重組人BMP7真核表達質粒pcDNA3.1-rhBMP7，經酶切和測序鑒定。在轉染試劑Effectene的介導下轉染軟骨細胞，轉染后培養(yǎng)液中加入G418篩選，通過逆轉錄PCR和實時熒光定量PCR檢測BMP7基因轉染軟骨細胞后的瞬時表達，采用G418篩選和免疫組化染色檢測BMP7基因轉染軟骨細胞后的穩(wěn)定表達。MTT法和S-100免疫組化檢測BMP7基因轉染對軟骨細胞生物學性狀的影響。結果：構建的真

12、核表達質粒pcDNA3.1-rhBMP7經酶切PCR及DNA測序證實。pcDNA3.1-BMP7轉染軟骨細胞經G418篩選，未得到轉染的細胞逐漸凋亡，轉染細胞長成細胞克隆，經逆轉錄PCR檢測，擴增得到了相應的DNA片段，而未經轉染的細胞則明顯表達較弱，實時熒光定量PCR檢測BMP7基因拷貝數在轉染后軟骨細胞和未轉染的軟骨細胞之間有顯著差異，證明rhBMP7基因轉染軟骨細胞后其BMP7表達水平有明顯變化。MTT法檢測證實rhBMP7基因轉

13、染軟骨細胞的表達產物對細胞的增殖有促進作用，S-100免疫組化檢測轉染細胞呈陽性反應，未轉染軟骨細胞為陰性。 第三部分Ⅰ型膠原/羥基磷灰石柱狀分層支架的構建及與軟骨細胞的體外相容性觀察 方法：Ⅰ型膠原/HA分層支架按以下步驟制備：將Ⅰ型膠原溶液加入分散的HA溶液中攪拌混合，加入EDC。調配形成不同比例的膠原-HA復合物，逐層加入模具，4℃靜置24h，放入-80℃過夜，再在冷凍干燥機中干燥12h后取出即可。選擇生長狀態(tài)良好

14、的第2、3代軟骨細胞消化離心，接種于Ⅰ型膠原/HA支架，經相差倒置顯微鏡、掃描電鏡、組織學和免疫組織化學檢測軟骨細胞與支架的相容性。 結果：Ⅰ型膠原/HA為具有一定機械強度的柱狀分層的三維多孔支架，最上層為純膠原，底層為純HA，中間為膠原與HA復合。掃描電鏡觀察，支架表面為純膠原，具有不規(guī)則的通孔結構，孔徑較均勻且相互連通，中間層為多孔的Ⅰ型膠原/HA復合。支架表面細胞數量較多，多數呈長梭形，支架內部細胞聚集成團，呈圓形或卵圓形

15、，細胞團中有基質分泌，沉積于細胞周圍，部分區(qū)域形成類似于軟骨陷窩樣結構，靠近支架底部細胞很少。Ⅱ型膠原免疫組化染色示胞漿內陽性反應。掃描電鏡觀察可見細胞成團地吸附于支架表面及孔隙側壁，并可見細胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上。 第四部分轉基因組織工程軟骨移植修復兔膝關節(jié)軟骨全層缺損方法：體外分離培養(yǎng)2周齡新西蘭大白兔關節(jié)軟骨細胞，部分細胞進行重組人BMP7基因轉染，將兩種細胞分別種植于Ⅰ型膠原/HA支架構建工程

16、軟骨復合體。在30只兔膝關節(jié)股骨髁或股骨滑車作一直徑3.5mm、深約3-4mm的軟骨缺損。分4組處理，即缺損曠置、單純支架植入、軟骨細胞+支架復合體植入、rhBMP7基因轉染軟骨細胞+支架復合體植入，分別于術后4、8、12、16周取材，進行大體觀察、組織學檢查和病理評分。 結論通過本實驗研究，得出以下結論：1.軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)會發(fā)生去分化現(xiàn)象，失去細胞表型，高密度培養(yǎng)能減緩該過程，在Ⅰ型膠原支架中三維立體培養(yǎng)有利

17、于維持其細胞表型及功能。2.外源性重組人BMP7基因轉染軟骨細胞可以獲得高效表達，其表達產物具有一定的維持軟骨細胞表型及促進軟骨細胞增殖的作用，為軟骨組織工程的研究提供了改良的種子細胞。 3.具有柱狀分層結構的Ⅰ型膠原/羥基磷灰石復合支架與軟骨細胞相容性良好，具有比膠原更強的力學性能，是比較理想的軟骨組織工程支架材料，但羥基磷灰石在體內降解緩慢，誘導成骨以重建軟骨下骨的性能也不夠理想是主要缺陷。 4.同種異體軟骨細胞移植