枯否細(xì)胞HO-1過表達(dá)阻斷肥大細(xì)胞脫顆粒抑制DC成熟和歸巢的機(jī)制研究.pdf

1、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase1，HO-1）是機(jī)體的一種自我保護(hù)性蛋白，在很多疾病模型中通過抗炎癥、抗細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡來發(fā)揮保護(hù)作用。結(jié)合我們前期的研究，通過上調(diào)供肝的 HO-1一方面可以穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜來減輕缺血再灌注造成的損傷；另一方面通過此機(jī)制可以抑制急性免疫排斥反應(yīng)。對(duì)HO-1進(jìn)行細(xì)胞定位的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的肝臟的HO-1主要定位于肝臟內(nèi)的枯否細(xì)胞。同時(shí)提出了供肝前置狀態(tài)的概念。在上述的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們提

2、出了相關(guān)假設(shè)：通過上調(diào)枯否細(xì)胞的 HO-1可以穩(wěn)定肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜，減少其脫顆粒，從而抑制樹突狀細(xì)胞的成熟降低其抗原提呈的能力，減少樹突狀細(xì)胞表面歸巢受體的表達(dá)阻斷其歸巢，從而發(fā)揮減輕免疫排斥的作用。
　　為了驗(yàn)證上述的假說我們提出此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：門靜脈灌注酶消化，密度梯度離心法分離提取肝臟的枯否細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)記，觀察其形態(tài)與功能。通過不同的處理因素（PBS、DMSO、 Hemin、Znpp）對(duì)枯否細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，運(yùn)用實(shí)

3、時(shí)熒光定量PCR、western blot技術(shù)檢測(cè)枯否細(xì)胞的HO-1的核酸和蛋白的表達(dá)變化。經(jīng)過預(yù)處理的枯否細(xì)胞通過與肥大細(xì)胞（mast cells MCs）接觸和隔離共培養(yǎng)檢測(cè)其脫顆粒程度來觀察肥大細(xì)胞的膜穩(wěn)定情況，進(jìn)一步觀察與枯否細(xì)胞相互作用后的肥大細(xì)胞對(duì)抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs）即樹突狀細(xì)胞(dendritic cells DCs)表面歸巢受體CCR7表達(dá)的影響和其表面共刺激分子表達(dá)

4、的影響觀察其歸巢遷移能力和成熟度；同時(shí)在體外建立單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)模型(mixed lymphocyte reaction，MLR)，檢測(cè)樹突狀細(xì)胞對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力的影響,評(píng)價(jià)過表達(dá)枯否細(xì)胞的 HO-1后對(duì)肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定的影響，從而對(duì)樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)功能影響。在體外闡明供肝前置狀態(tài)中枯否細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞這些免疫學(xué)細(xì)胞的相互作用機(jī)制。
　　第1部體外肝源性枯否細(xì)胞的分離、鑒定及HO-1表達(dá)
　　目的：<

5、br>　　為研究枯否細(xì)胞過表達(dá)HO-1對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的影響并進(jìn)一步對(duì)樹突狀細(xì)胞生物學(xué)功能的影響提供細(xì)胞基礎(chǔ)，并在體外觀察枯否細(xì)胞HO-1的表達(dá)變化。
　　方法：
　　門靜脈灌注酶消化，密度梯度離心法分離提取枯否細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其特異性的表面分子，觀察其形態(tài)來鑒定所獲得枯否細(xì)胞的純度。將獲得的枯否細(xì)胞經(jīng)過PBS、DMSO、Hemin、Znpp等因素進(jìn)行預(yù)處理8h后，提取其總的核酸和總蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察枯否細(xì)胞H

6、O-1的mRNA表達(dá)，采用Western blot法觀察枯否細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　分離提取的枯否細(xì)胞在光鏡下觀察為圓形，處于懸浮和半貼壁狀態(tài)，符合文獻(xiàn)報(bào)道的枯否細(xì)胞特征。流式細(xì)胞術(shù)鑒定枯否細(xì)胞表面的特異性分子F4/80和CD11b雙陽性表達(dá)90％以上。分離提取的枯否細(xì)胞經(jīng)Hemin處理8h后，其 HO-1在核酸和蛋白水平的表達(dá)明顯升高。而 Znpp組的 HO-1的核酸和蛋白與對(duì)照組相比差異變化較小。但與H

7、emin處理組相比有明顯變化。
　　結(jié)論：
　　通過門靜脈灌注酶消化，密度梯度離心法可以獲得足夠的枯否細(xì)胞為后續(xù)實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備，體外經(jīng)Hemin處理的枯否細(xì)胞可以高表達(dá)HO-1。
　　第2部枯否細(xì)胞HO-1的過表達(dá)對(duì)MC膜穩(wěn)定的影響
　　目的：
　　在前期中，我們驗(yàn)證了上調(diào)肝臟的 HO-1可以穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜從而減輕缺血再灌注損傷減輕急性排斥反應(yīng)，并在體觀察氯化釓阻斷枯否細(xì)胞的功能后再上調(diào)其HO-1肝臟的缺血再灌

8、注損傷不能減輕，定位研究發(fā)現(xiàn)HO-1于枯否細(xì)胞內(nèi)。為探討這一機(jī)制我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)過表達(dá)枯否細(xì)胞的 HO-1，與肥大細(xì)胞相互作用后，刺激肥大細(xì)胞脫顆粒，觀察過表達(dá)HO-1的枯否細(xì)胞對(duì)肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定的影響。
　　方法：
　　將分離提取的枯否細(xì)胞經(jīng)PBS、DMSO、Hemin、Znpp各處理因素預(yù)處理8h后，收集預(yù)處理的細(xì)胞。將收集的細(xì)胞與肥大細(xì)胞接觸或者用transwell隔層共培養(yǎng)24h,用anti-DNP IgE mAb聯(lián)合D

9、NP-HAS來刺激肥大細(xì)胞使其脫顆粒，檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的活性來反應(yīng)肥大細(xì)胞的脫顆粒情況的表達(dá)變化。流式細(xì)胞術(shù)鑒定肥大細(xì)胞表面的Fcε受體的表達(dá)。ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞上清中的IL-9,IL-33，IFN-γ,IL-10,TGF-β等細(xì)胞因子來觀察枯否穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　過表達(dá) HO-1的枯否細(xì)胞與肥大細(xì)胞無論是接觸共培養(yǎng)還是經(jīng)過transwell隔層共培養(yǎng)，肥大細(xì)胞脫顆粒都明顯減少，肥大細(xì)胞

10、表面的 Fcε受體分子表達(dá)相對(duì)較低。過表達(dá)HO-1的枯否細(xì)胞與肥大細(xì)胞共培養(yǎng)體系中細(xì)胞上清細(xì)胞因子IL-9，IL-33，IL-10，TGF-β表達(dá)升高，IFN-γ表達(dá)下降。結(jié)論：
　　我們的實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá) HO-1的枯否可以穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜減少其脫顆粒，其可能的機(jī)制是上調(diào)枯否細(xì)胞的HO-1后分泌的細(xì)胞因子IL-9，IL-33，IL-10，TGF-β增加，這種細(xì)胞因子對(duì)穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜有作用。
　　第3部枯否細(xì)胞過表達(dá)HO-1穩(wěn)定

11、MC膜后對(duì)DC生物學(xué)功能的影響
　　目的：
　　為了驗(yàn)證我們提出的假說機(jī)制：過表達(dá)枯否細(xì)胞的HO-1穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜后可以減少肥大細(xì)胞的脫顆粒，觀察膜穩(wěn)定的肥大細(xì)胞進(jìn)一步對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟度、歸巢能力和對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)增殖能力等各生物學(xué)功能的影響。
　　方法：
　　將經(jīng)過不同處理因素（PBS、DMSO、Hemin、Znpp）預(yù)處理的枯否細(xì)胞與肥大細(xì)胞相互作用并刺激肥大細(xì)胞脫顆粒后，在此培養(yǎng)體系中加入樹突狀細(xì)胞，

12、培養(yǎng)24小時(shí)。流式細(xì)胞術(shù)分析表面表達(dá)CD11c的細(xì)胞群中細(xì)胞表面的共刺激分子CD86、CD80和CD40的表達(dá)，并分析其表達(dá)CCR7歸巢受體的表達(dá)；Transwell觀察枯否細(xì)胞過表達(dá)HO-1穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜后對(duì)樹突狀細(xì)胞的遷移能力的影響，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)體系細(xì)胞上清中PGE2、 CCL21和CCL19的表達(dá)。CCK8檢測(cè)培養(yǎng)體系中的樹突狀細(xì)胞在單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力的影響。
　　結(jié)果：
　

13、　過表達(dá)HO-1的枯否細(xì)胞穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜刺激其脫顆粒后，與樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)，其表面的共刺激分子低表達(dá)，表面的歸巢受體CCR7相對(duì)于Znpp組表達(dá)下降，遷移能力下降。培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子 PGE2、CCL21和 CCL19表述升高，刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力下降。
　　結(jié)論：
　　枯否細(xì)胞過表達(dá)HO-1穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜減少其脫顆粒后可能是通過維持樹突狀細(xì)胞的非成熟狀態(tài)并阻斷其歸巢，降低其作為抗原提呈細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞的能