細(xì)胞、肥大細(xì)胞活化機(jī)制的研究.pdf

1、腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，腫瘤微環(huán)境中各種成分之間的相互作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的決定因素。因此在進(jìn)行腫瘤研究時(shí)，對于腫瘤微環(huán)境的探討尤為重要。越來越多的證據(jù)表明，浸潤到腫瘤微環(huán)境中的髓源細(xì)胞對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起到重要作用，其中包括巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。但其在腫瘤微環(huán)境中功能變化的機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并初步探討其機(jī)制。本研究分四部分，分別研究巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的功

2、能變化：
　　 第一、二部分：腫瘤微環(huán)境對巨噬細(xì)胞的影響。我們采用H22細(xì)胞和骨髓F4/80+細(xì)胞，即Gr-1+CD11b+F4/80+骨髓來源單核細(xì)胞（Bone marrow-derived monocytes，BMDMs）混合接種小鼠，或瘤內(nèi)注射骨髓F4/80+細(xì)胞的方法，發(fā)現(xiàn)骨髓F4/80+細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生促瘤生長功能。因此我們采用了反復(fù)凍融法制備壞死腫瘤細(xì)胞釋放物（molecules from necrotic t

3、umor cells，NTC-Ms）模擬腫瘤微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)NTC-Ms能促進(jìn)腫瘤生長；且NTC-Ms誘導(dǎo)骨髓F4/80+細(xì)胞具有了MDSC表型，能抑制T細(xì)胞增殖。由于NTC-Ms中含有大量的內(nèi)源性Toll樣受體配體，我們采用肌肉內(nèi)轉(zhuǎn)染sTLR4表達(dá)載體的方法，觀察是否TLR4參與了NTC-Ms對骨髓F4/80+細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。結(jié)果顯示：sTLR4能顯著抑制腫瘤生長；當(dāng)剛出現(xiàn)可觸及腫瘤時(shí)（7d），sTLR4能使腫瘤組織內(nèi)F4/80+細(xì)胞Ar

4、g1基因轉(zhuǎn)錄水平下降，而Nos2和IL-12基因轉(zhuǎn)錄水平升高。我們進(jìn)一步觀察了腫瘤組織和腫瘤免疫治療組織中F4/80+細(xì)胞的表型，發(fā)現(xiàn)均為Gr-1+CD11b+F4/80+，而sTLR4同樣也能增加腫瘤免疫治療組織中F4/80+細(xì)胞Nos2和IL-12轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)4-1BBL/sPD-1腫瘤抑制作用；且更進(jìn)一步降低了腫瘤免疫治療組織中F4/80+細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的能力。以上結(jié)果表明；在腫瘤微環(huán)境中，NTC-Ms通過TLR4途徑誘導(dǎo)巨

5、噬細(xì)胞產(chǎn)生促瘤生長功能；腫瘤免疫治療過程中，腫瘤細(xì)胞的破壞也可通過TLR4影響巨噬細(xì)胞。
　　 第三、四部分：腫瘤微環(huán)境對肥大細(xì)胞的影響。我們采用骨髓來源肥大細(xì)胞（bone marrow-derived mast cells，BMMCs）和H22細(xì)胞混合接種或瘤內(nèi)注射BMMCs的方法，發(fā)現(xiàn)BMMCs在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生促瘤生長功能。由于SCF是肥大細(xì)胞分化成熟的重要因子，因此我們觀察了SCF對BMMCs的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCF預(yù)處理

6、的BMMCs抑瘤作用減弱。接下來我們用NTC-Ms、TI-Ms模擬腫瘤微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)NTC-Ms、TI-Ms預(yù)處理的BMMCs能促進(jìn)腫瘤生長，而resveratrol、QNZ減弱了NTC-Ms的作用，提示TLR4和SCF可能參與了NTC-Ms對BMMCs的誘導(dǎo)作用。因此，我們首先證明了NTC-Ms和TI-Ms中含有功能性SCF，然后用SCF和TLR4的特異性配體LPS協(xié)同刺激BMMCs，發(fā)現(xiàn)BMMCs產(chǎn)生了促瘤生長功能；而在瘤內(nèi)注射BMM

7、Cs的模型中，肌肉內(nèi)轉(zhuǎn)染sTLR4表達(dá)載體，則減弱了肥大細(xì)胞的促瘤功能，進(jìn)一步說明SCF和TLR4配體增強(qiáng)了肥大細(xì)胞促瘤生長潛能。為了明確SCF和TLR4配體發(fā)揮作用的機(jī)制，我們觀察了不同處理?xiàng)l件下，BMMCs脫顆粒、IL-10表達(dá)和對腫瘤生長的影響。結(jié)果顯示，SCF/LPS、NTC-Ms和TI-Ms均能抑制肥大細(xì)胞自發(fā)脫顆粒，但不影響VEGF和PDGF的表達(dá)；且SCF/LPS、NTC-Ms和TI-Ms均能刺激BMMCs表達(dá)IL-10；

8、resveratrol、wortmannin和QNZ可抑制NTC-Ms的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SCF和TLR4配體抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和產(chǎn)生IL-10的功能涉及Tyr216-GSK3β磷酸化，其磷酸化抑制劑LiCl抑制腫瘤生長，消除了NTC-Ms、SCF/LPS對BMMCs自發(fā)性脫顆粒的抑制作用，且減弱了NTC-Ms、SCF/LPS誘導(dǎo)的BMMCs IL-10表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境中的SCF和TLR4配體共同作用于肥大細(xì)胞，通