抗小鼠TLR2抗體TSP-2抑制小鼠肥大細(xì)胞脫顆粒作用的初步研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)是果蠅Toll的同系物，它們構(gòu)成一個(gè)新的蛋白家庭家族，是一類與天然免疫關(guān)系密切的模式識(shí)別受體，參與天然免疫的介導(dǎo)并激活獲得性免疫。其共同特點(diǎn)是胞外段有富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)，胞內(nèi)段與IL-1受體具同源性；其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要經(jīng)IL-1R相關(guān)激酶(IRAK)，導(dǎo)致NF-κB激活，繼而產(chǎn)生細(xì)胞因子。自1997年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)哺乳動(dòng)物TLRs以來，迄今為止已發(fā)現(xiàn)TLRs分

2、子約12個(gè)，即Toll1-11和18-wheeler。研究表明，TLRs不僅參與天然免疫與感染免疫，還可參與非感染免疫及獲得性免疫，如抗原遞呈、誘導(dǎo)免疫耐受、細(xì)胞凋亡，并以此在自身免疫病、超敏反應(yīng)、移植排斥及腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。而某些TLRs能誘導(dǎo)抑制或增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的相關(guān)細(xì)胞因子如IL-10，IL-4，IL-5和IL-13的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子在炎癥導(dǎo)致的病理損傷和機(jī)體防御中均起重要作用。目前認(rèn)為過敏性疾病與Th2型T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因

3、子密切相關(guān)，如Th2型細(xì)胞因子IL-4能誘導(dǎo)IgE的產(chǎn)生，IL-5可趨化嗜酸性粒細(xì)胞聚集；而與感染有關(guān)的Th1型細(xì)胞因子如IL-12、IFN-γ等則能抑制Th2型細(xì)胞因子的作用，從而抑制過敏反應(yīng)的炎癥反應(yīng)。正如有人提出的衛(wèi)生學(xué)假說，幼兒及青少年時(shí)期發(fā)生感染機(jī)會(huì)減少則過敏癥的發(fā)病率相應(yīng)升高。哺乳動(dòng)物的很多TLRs都參與了過敏性炎癥過程，其中以TLR2、TLR4和TLR9研究較多；已知TLR2是人類TLRs家族成員中表達(dá)范圍最廣、識(shí)別病原微

4、生物及其產(chǎn)物種類最多的分子，被認(rèn)為是所有TLRs中具中心作用的或中樞型識(shí)別(centralpatternrecognition)受體。TLR2分子主要表達(dá)在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、γ/δT、Th1、Th2α/βT，尤其在脾臟和外周血白細(xì)胞高表達(dá)，其次在部分消化道上皮細(xì)胞株、B細(xì)胞株及大鼠心肌細(xì)胞、腦組織、齒齦細(xì)胞等也有表達(dá)。盡管有許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TLR2與一些配基相互作用參與了免疫相關(guān)事件，但是關(guān)于TLR2抗體的作用研究報(bào)道很少。

5、另外，有很多研究表明肥大細(xì)胞膜上的TLR2在介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。 小鼠TLR2(mTLR2)和人TLR2(hTLR2)氨基酸水平上有83％的同源性，在分布、生物學(xué)活性方面的諸多相似，且小鼠肥大細(xì)胞可表達(dá)TLR2和TLR4，而人的肥大細(xì)胞僅表達(dá)TLR2，因此研究TLR-2就更為具實(shí)際意義，而小鼠無疑是研究TLR2以及它與相應(yīng)配基及抗體相互作用、作用的效應(yīng)等的良好模型。本課題組已有的研究工作發(fā)現(xiàn)，在對(duì)OVA致敏的小鼠進(jìn)行

6、攻擊前，靜脈注射抗小鼠TLR2胞外段(mouseTLR2extracellulardomain，mTLR-2ECD)單表位抗體TSP-2能有效地抑制OVA引發(fā)的過敏性休克，有關(guān)機(jī)制正在研究中。國內(nèi)外已有的研究結(jié)果表明TLR2與其某些配基如PGN、Pam3CSK4等的相互作用參與了過敏性哮喘炎癥過程，本研究對(duì)抗小鼠TLR2抗體TSP-2在體內(nèi)對(duì)小鼠過敏性哮喘和腹膜炎以及在體外對(duì)小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞P815細(xì)胞中的作用進(jìn)行了初步研究。觀察了T

7、SP-2在OVA誘導(dǎo)的小鼠支氣管哮喘和酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎中炎性細(xì)胞滲出和炎性介質(zhì)如組胺、白三烯等變化的影響；并觀察了抗mTLR2胞外段抗體TSP-2對(duì)非過敏原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒的作用。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 一、抗mTLR2ECDTSP-2抑制c48/80誘導(dǎo)小鼠肥大細(xì)胞脫顆粒的作用在本研究中，我們用mTLR2不同表位的合成肽和融合蛋白作為抗原免疫家兔并純化獲得了兩種抗mTLR-2胞外段抗體TSP-2和T

8、SP-3。從理論上分析，由于TSP-3設(shè)計(jì)的是針對(duì)mTLR-2胞外段13-165氨基酸區(qū)域6個(gè)B識(shí)別表位，屬于典型的多克隆抗體，而TSP-2僅針對(duì)1個(gè)B識(shí)別表位，且與TSP-3不在同一區(qū)域，再經(jīng)過免疫親和層析純化后，獲得的這種抗體雖為多克隆，卻為單表位特異性。從結(jié)合活性方面幾乎類似于單克隆抗體。且ELISA檢測(cè)的抗體結(jié)合效價(jià)結(jié)果也說明抗體TSP-2比TSP-3更為敏感，這為我們進(jìn)行mTLR-2相關(guān)功能的研究提供了極大的便利。 已

9、知合成化合物C48/80(Compound48/80Phenethylamine，p-methoxy-N-methyl)可直接誘發(fā)的肥大細(xì)胞脫顆粒，其機(jī)制為激活G蛋白并引起SyK活化。為了觀察在體外抗小鼠TLR-2胞外段單表位抗體(TSP-2)對(duì)C48/80誘導(dǎo)的P815肥大瘤細(xì)胞脫顆粒的影響。首先利用RT-PCR、免疫組化以及免疫熒光方法證實(shí)了小鼠肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞在mRNA水平的表達(dá)，及細(xì)胞膜表面的TLR-2與抗體TSP-2的結(jié)

10、合，并利用組化染色與激光共聚焦顯微鏡觀察了抗mTLR2ECD單表位抗體TSP-2對(duì)C48/80誘導(dǎo)的P815肥大瘤細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)所致的形態(tài)學(xué)改變與鈣流出的影響。結(jié)果顯示P815細(xì)胞在mRNA水平以及膜表面均有TLR2表達(dá)，抗體TSP-2能有效抑制C48/80誘導(dǎo)的P815肥大瘤細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)所致的形態(tài)學(xué)改變與鈣流出。上述結(jié)果表明抗體TLR2可抑制非過敏原物質(zhì)C48/80誘發(fā)的肥大細(xì)胞脫顆粒。 二、抗mTLR-2ECD抗體TSP-

11、2抑制酵母多糖誘發(fā)小鼠腹膜炎的研究 已知酵母多糖誘發(fā)的小鼠急性腹膜炎中腹腔灌洗液的炎性細(xì)胞滲出顯著增多，其中主要是單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞[41]，即利用酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎病理變化主要由肥大細(xì)胞介導(dǎo)。在此基礎(chǔ)上，本部分工作研究了抗mTLR-2ECD單表位抗體TSP-2在酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎模型中的主要作用，以正常未處理小鼠為對(duì)照，設(shè)立PBS組、正常兔IgG、抗體TSP-2組和抗體TSP-3組，各組在腹腔注射(i.p.)酵母多糖誘

12、導(dǎo)模型前，靜脈注射(i.v.)PBS、正常兔IgG、抗體TSP-2和抗體TSP-3，最后收集腹腔灌洗液，并觀察了抗體TSP-2對(duì)模型動(dòng)物的扭身次數(shù)、腹腔灌沈液的伊文思蘭滲出、腹腔白細(xì)胞浸潤的數(shù)量變化、腹腔肥大細(xì)胞脫顆粒情況以及腹腔灌洗液離心上清中PAF和TNFa水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PBS處理組、抗體TSP-3以及正常兔IgG組相比，抗體TSP-2能抑制小鼠因腹腔炎癥引起的扭身次數(shù)、腹腔灌洗液中伊文思藍(lán)OD值降低、腹腔灌洗液中白細(xì)

13、胞滲透和C48/80誘導(dǎo)的腹腔肥大細(xì)胞脫顆粒。提示抗體TSP-2可能通過對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制作用減輕酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠的腹膜炎炎癥。 三、抗mTLR-2ECD抗體TSP-2對(duì)小鼠過敏性哮喘氣道炎癥的影響 已知在小鼠實(shí)驗(yàn)性過敏性哮喘模型中，某些TLR2的配基如PGN,Pam3CSK4能介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化脫顆粒從而加劇過敏性哮喘的炎癥反應(yīng)，這說明TLR2通過與其配基的相互作用介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化進(jìn)而參與了過敏性哮喘，但尚未見關(guān)于

14、TLR2與其抗體作用參與過敏性反應(yīng)的相關(guān)研究報(bào)道。 本部分實(shí)驗(yàn)利用OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型，觀察了抗體TSP-2對(duì)小鼠過敏性哮喘模型氣道炎癥的影響。模型動(dòng)物采用純系BALB/c小鼠，根據(jù)激發(fā)哮喘前尾靜脈注射的液體不同分為TSP-2組、正常兔IgG組、PBS組和正常未致敏組，各組分別在0和14天用100μg的OVA福氏完全佐劑混合后腹腔免疫小鼠，并在第14天，鼻內(nèi)麻醉小鼠，補(bǔ)加免疫1次，即用100μgOVA40μl給小鼠滴鼻；各組

15、分別在第25、26和27天利用OVA激發(fā)誘導(dǎo)過敏性哮喘，各組用含10μgOVA的PBS40μl滴鼻，正常對(duì)照組用等量PBS滴鼻；除正常對(duì)照組外，各組在每次OVA激發(fā)前6h根據(jù)分組分別進(jìn)行尾靜脈注射兔IgG(3mg/kg)、抗體TSP-2(3mg/kg)和PBS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜脈給予抗體TSP-2能有效的抑制氣道炎癥和炎癥細(xì)胞的浸潤。與正常兔IgG相比，抗體TSP-2的抑制作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：肺泡灌洗液中的白細(xì)胞浸潤減少；減輕攻擊