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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景及目的:
近幾年隨著空氣污染等環(huán)境變化,過(guò)敏性疾病的發(fā)病率顯著上升,其中包括Ⅰ型超敏反應(yīng)。Ⅰ型超敏反應(yīng)發(fā)病突然,嚴(yán)重時(shí)可能威脅生命。在自然界廣泛存在能夠致敏的抗原性物質(zhì),它們可以經(jīng)呼吸道消化道或皮膚接觸等途徑進(jìn)入體內(nèi),刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白E(IgE)。隨后IgE分子可以同肥大細(xì)胞表面受體FcεRI穩(wěn)定結(jié)合。FcεRI是一條α鏈、一條β鏈和兩條相同的γ鏈組成的四聚體。α鏈?zhǔn)桥潴w結(jié)合鏈,其胞外區(qū)能和Ig
2、E的Fc段結(jié)合;β鏈和γ鏈有ITAM區(qū),發(fā)生磷酸化后介導(dǎo)下游信號(hào)傳遞。當(dāng)特異抗原再次進(jìn)入體內(nèi),可以同IgE分子結(jié)合并且使相鄰的兩個(gè)FcεRI交聯(lián),引起肥大細(xì)胞活化。肥大細(xì)胞活化后通過(guò)脫顆粒和分泌炎性因子等發(fā)揮其生物學(xué)作用。
體內(nèi)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度和范圍受到多種機(jī)制調(diào)節(jié),其中包括細(xì)胞表面激活性受體和抑制性受體平衡所起到的調(diào)控作用。信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白家族(signal regulatory protein family)就是一類(lèi)細(xì)胞表面
3、的抑制性受體。信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)是一種廣泛存在的抑制性受體,屬于免疫球蛋白受體超家族。SIRPα主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞及髓系非淋巴細(xì)胞,如肥大細(xì)胞。SIRP胞外區(qū)具有三個(gè)IgSF樣結(jié)構(gòu)域和多個(gè)糖基化位點(diǎn),胞內(nèi)區(qū)帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIMs),其中含四個(gè)酪氨酸殘基,磷酸化后能夠募集含SH2結(jié)構(gòu)域的分子如蛋白磷酸酶SHP-1和SHP-2。
肥大細(xì)胞作為過(guò)敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞,抑制性受體SIRPα對(duì)其功能的調(diào)節(jié)尚未
4、見(jiàn)系統(tǒng)性報(bào)道。我們研究發(fā)現(xiàn)抗原活化肥大細(xì)胞后SIRPα蛋白表達(dá)水平下降,提示SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞活化可能存在抑制作用。為進(jìn)一步了解SIRPα在肥大細(xì)胞活化過(guò)程以及Ⅰ型超敏反應(yīng)中的作用,本課題通過(guò)利用差異表達(dá)SIRPα的細(xì)胞進(jìn)行研究,研究了SIRPα在抗原誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化中的作用。重點(diǎn)是SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒及分泌細(xì)胞因子的影響及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。
實(shí)驗(yàn)方法:
1.建立穩(wěn)定高表達(dá)Myc-SIRPα和轉(zhuǎn)染空
5、載體對(duì)照的肥大細(xì)胞系。分離培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞(BMMCs),合成鑒定具有特異干擾效果signA,瞬時(shí)干擾SIRPα表達(dá),構(gòu)建BMMCssiSIRPα和BMMCscontrol細(xì)胞;
2.采用特異性磷酸化抗體檢測(cè)SIRPα差異表達(dá)的肥大細(xì)胞在抗原刺激后p38、JNK、ERK、Akt、NFAT等信號(hào)分子的磷酸化水平變化,反映SIRPα對(duì)信號(hào)通路活化的調(diào)節(jié);
3.運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)SIRPα對(duì)NF-
6、κB,NFAT轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié);
4.通過(guò)檢測(cè)肥大細(xì)胞活化后β-氨基己糖胺酶的釋放,研究SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的調(diào)節(jié);
5.采用Real-timePCR方法檢測(cè)肥大細(xì)胞炎性因子的mRNA水平;
6.采用熒光探針檢測(cè)SIRPα對(duì)細(xì)胞骨架F-actin聚合的調(diào)節(jié);
7.使用Ca2+指示劑檢測(cè)SIRPα對(duì)抗原引起肥大活化過(guò)程中Ca2+流動(dòng)的調(diào)節(jié);
8.用Westernbl
7、ot檢測(cè)SIRPα對(duì)細(xì)胞骨架微管形成的影響;
10.將BMMCssiSIRPα及陰性對(duì)照細(xì)胞輸入肥大細(xì)胞缺失小鼠(c-kitwsh/wsh)體內(nèi),重構(gòu)肥大細(xì)胞系統(tǒng)。進(jìn)行被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng),體內(nèi)觀察SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。
11.采用免疫組織沉淀的方法檢測(cè)SIRPα與SHP-2的結(jié)合,SHP-2與PI3Kp85和IKKβ的相互作用。
結(jié)果:
1.SIRPα參與抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞
8、活化過(guò)程:在肥大細(xì)胞活化過(guò)程中,SIRPα蛋白表達(dá)降低,并呈現(xiàn)抗原劑量與時(shí)間依賴性。同時(shí),SIRPα發(fā)生磷酸化并募集SHP-1和SHP-2。
2.SIRPα調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化后分泌功能:SIRPα顯著抑制肥大細(xì)胞脫顆粒及細(xì)胞因子合成。
3.SIRPα抑制肥大細(xì)胞活化過(guò)程中的細(xì)胞骨架改變:SIRPα抑制肥大細(xì)胞活化過(guò)程中α-tubulin聚合及F-actin解聚。
4.SIRPα抑制肥大細(xì)胞活化過(guò)程
9、中的Ca2+釋放,提示SIRPα通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+釋放影響肥大細(xì)胞骨架改變及脫顆粒過(guò)程。
5.SIRPα對(duì)Ⅰ型超敏反應(yīng)過(guò)程中血管滲出的影響:與對(duì)照小鼠相比,輸入低表達(dá)SIRPα肥大細(xì)胞的小鼠皮下滲出更加明顯。這進(jìn)一步說(shuō)明SIRPα抑制肥大細(xì)胞分泌功能。
6.SIRPα抑制細(xì)胞骨架重構(gòu)的機(jī)制:抗原引起肥大細(xì)胞活化過(guò)程中,SIRPα明顯抑制PLCγ1磷酸化,從而抑制Ca2+釋放。此外SIRPα明顯抑制Rac-1GT
10、Pase及PAK1的活性,進(jìn)而抑制了微管的形成。
7.SIRPα影響肥大細(xì)胞細(xì)胞因子合成分泌的機(jī)制:抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化過(guò)程中,SLRPα通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路磷酸化以及轉(zhuǎn)錄因子NFκB和NFAT活性,抑制肥大細(xì)胞由抗原誘導(dǎo)的炎性因子合成與分泌。
8.SIRPα在抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的機(jī)制:肥大細(xì)胞活化后,SIRPα通過(guò)Src家族激酶發(fā)生磷酸化。隨后SIRPα通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SHP-2
11、,影響SHP-2與PI3Kp85及IKKβ的結(jié)合,抑制Akt與NF-κB信號(hào)通路。
結(jié)論:
本研究從分子-細(xì)胞-動(dòng)物水平較深入研究了信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用,發(fā)現(xiàn)SIRPα負(fù)性調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化,包括抑制肥大細(xì)胞脫顆粒及炎性因子合成并對(duì)體內(nèi)的過(guò)敏反應(yīng)能力具有負(fù)向調(diào)控能力。同時(shí)本研究進(jìn)一步探討了SIRPα調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制,證明SIRPα可能通過(guò)抑制SHP-2與IKKβ及PI3K
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