人乳牙牙髓干細(xì)胞成軟骨及成骨特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 自組織工程學(xué)的概念提出以來,種子細(xì)胞、生物支架材料、培養(yǎng)環(huán)境就一直是重要的組成三要素,而其中種子細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)與再生的前提和基礎(chǔ)。干細(xì)胞以其自身獨(dú)具的特性在諸多候選種子細(xì)胞中顯示出了很大的優(yōu)勢。胚胎干細(xì)胞(embryonicstem cells,ESCs)雖然具有分化成所有類型細(xì)胞的潛能,但其存在異體移植倫理制約的問題,這也就使得成體干細(xì)胞(adultstem cells,ASCs)成為目前組織工程種子細(xì)

2、胞的研究熱點(diǎn)[1-3],并且已經(jīng)在促進(jìn)骨和軟骨缺損修復(fù)已及顱面部組織再生方向取得了一定的成果。
　　 在成體干細(xì)胞中,乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells derived from human exfoliateddeciduous teeeh,SHED)是近幾年再生醫(yī)學(xué)中又一極具應(yīng)用潛力的種子細(xì)胞,SHED具有離成熟細(xì)胞近、可塑性強(qiáng)、免疫排斥小以及高度增殖能力和多向分化的潛能,并且在一定條件下SHED可向特定的細(xì)胞類型分化,產(chǎn)

3、生數(shù)個(gè)亞系的前體細(xì)胞。除此之外目前研究還發(fā)現(xiàn)乳牙牙髓干細(xì)胞具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨能力,對(duì)骨缺損的修復(fù)具有十分重要的意義。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),將SHED與β-TCP復(fù)合培養(yǎng)后植入裸鼠體內(nèi)可形成典型的軟骨化骨的結(jié)構(gòu),說明移植材料在沒有任何其他誘因的前提下,可在裸鼠體內(nèi)自主發(fā)生軟骨成骨。
　　 就目前報(bào)道來看,許多成體干細(xì)胞都具有向軟骨細(xì)胞分化的潛能,有些成體干細(xì)胞已經(jīng)運(yùn)用于軟骨組織的修復(fù)中,但未見SHED是否具有向軟骨細(xì)胞分化能力的研究

4、報(bào)道。而近些年SHED向成骨細(xì)胞分化的研究較多,但這些研究都是基于未特異性選擇的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。因此本課題第一部分旨在探索體外培養(yǎng)SHED在誘導(dǎo)體系的作用下,通過觀察軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)記物來確定SHED是否具有向軟骨細(xì)胞分化的特性。實(shí)驗(yàn)第二部分,運(yùn)用流式細(xì)胞儀選擇帶有特異性標(biāo)記的SHED,分不同時(shí)間點(diǎn)觀察分選后的細(xì)胞自行分化為成骨細(xì)胞的過程,目的為后續(xù)的SHED在體內(nèi)參與軟骨組織及骨組織修復(fù)提供一定的參考依據(jù)。
　　 第-章 人乳牙

5、牙髓干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 一、方法：
　　 1 SHED的收集和培養(yǎng)
　　 依據(jù)Miura等[4]的實(shí)驗(yàn)方法選取6～10歲健康兒童的滯留的乳牙,采用酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞。將拔出的牙髓組織通過消化、過濾后得到細(xì)胞懸液,然后鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
　　 2 SHED的觀察和鑒定
　　 2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 觀察原代和傳代細(xì)胞生長、增殖情況以及形態(tài)特征,HE染色觀察

6、原代細(xì)胞組織學(xué)特征。
　　 2.2細(xì)胞表面抗原鑒定
　　 對(duì)原代細(xì)胞行細(xì)胞免疫化學(xué)染色分析,觀察STRO-1的表達(dá)情況。
　　 2.3成脂分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
　　 取原代細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)液條件下培養(yǎng),觀察到脂滴形成后行油紅-O染色。
　　 3 SHED體外誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞
　　 3.1誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 參照J(rèn)ohnstone B等[5]實(shí)驗(yàn)方法對(duì)培養(yǎng)的第2代SHED進(jìn)行誘導(dǎo)2周后,

7、HE染色觀察分化后的細(xì)胞的形態(tài)組織學(xué)特征。
　　 3.2甲苯胺藍(lán)和番紅-O染色
　　 對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)分化后的SHED細(xì)胞行甲苯胺藍(lán)和番紅-O染色觀察分化后的細(xì)胞內(nèi)外糖胺聚糖和蛋白多糖的表達(dá)情況。
　　 3.3 Ⅱ型膠原及Aggrecan的表達(dá)情況
　　 對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)分化后的SHED細(xì)胞行免疫化學(xué)細(xì)胞染色和免疫熒光染色觀察Ⅱ型膠原及Aggrecan的表達(dá)情況
　　 3.4 RT-PCR檢測Ⅱ型膠原基因表達(dá)

8、r>　　 運(yùn)用RT-PCR方法檢測定向誘導(dǎo)分化后的SHED細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原在基因水平的表達(dá)情況。
　　 二、結(jié)果
　　 1 SHED的分離和培養(yǎng)
　　 原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般在鋪瓶3天后倒置顯微鏡下見貼壁細(xì)胞生長,形態(tài)呈現(xiàn)多形性。隨著生長傳代,細(xì)胞較多的出現(xiàn)梭形成纖維細(xì)胞樣并且大小趨近一致。
　　 2 SHED的觀察和鑒定
　　 2.1細(xì)胞HE染色觀察
　　 原代細(xì)胞爬片HE染色:大部分細(xì)胞呈

9、梭形,體積較小,輪廓清晰。細(xì)胞核為圓形或卵圓形,體積較大。少數(shù)細(xì)胞內(nèi)可見多個(gè)核仁存在。
　　 2.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞表面抗原
　　 對(duì)原代培養(yǎng)的SHED行抗STRO-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈陽性表達(dá)。
　　 2.3體外成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
　　 細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)體系的的作用下,約15d可見個(gè)別細(xì)胞胞漿能出現(xiàn)高強(qiáng)度的折射點(diǎn),20d左右亮點(diǎn)增多并有融合,油紅-O染色呈陽性。
　　 3

10、SHED體外定向誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞
　　 3.1誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 誘導(dǎo)兩周后細(xì)胞行HE染色:細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)檐浌羌?xì)胞典型的多邊形形態(tài),細(xì)胞體積較小,胞核深染。
　　 3.2 甲苯胺藍(lán)染色和番紅-O染色
　　 對(duì)經(jīng)向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的SHED細(xì)胞行甲苯胺藍(lán)和番紅-O染色結(jié)果均為陽性。
　　 3.3檢測成軟骨細(xì)胞特性標(biāo)記物
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察Ⅱ型膠原呈陽性表達(dá),免疫熒光染色觀

11、察可見Aggrecan有陽性表達(dá)。
　　 3.4 RT-PCR檢測Ⅱ型膠原基因表達(dá)
　　 誘導(dǎo)2周后可見特異性的Ⅱ型膠原在300-400bp有表達(dá)。
　　 三、結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)成功對(duì)人乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),并在體外定向向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后,對(duì)細(xì)胞形態(tài)及軟骨細(xì)胞的表型進(jìn)行鑒定,證實(shí)人乳牙牙髓干細(xì)胞在體外具有分化為軟骨細(xì)胞的潛能。
　　 第二章 人乳牙牙髓干細(xì)胞體外成骨特性的實(shí)驗(yàn)研究
　　

12、 一、方法
　　 1 SHED的收集和培養(yǎng)
　　 同實(shí)驗(yàn)第一部分
　　 2 流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞
　　 當(dāng)?shù)?代乳牙牙髓干細(xì)胞細(xì)胞生長融合成單層后,消化制成單細(xì)胞懸液加入FITC-CD34和PE-CD117抗體,經(jīng)流式細(xì)胞儀分選出兩組細(xì)胞。A組:CD34+/CD117+雙陽性表達(dá)的細(xì)胞,B組:剩余的混雜細(xì)胞。
　　 3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 倒置顯微鏡觀察分選后A、B兩組細(xì)胞的生長形態(tài),組織

13、學(xué)HE染色觀察。
　　 4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測SHED向成骨細(xì)胞分化
　　 分選后的細(xì)胞培養(yǎng)30d時(shí),用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察A、B兩組細(xì)胞RUNX-2、OC、BSP的表達(dá)。
　　 5 熒光定量PCR技術(shù)檢測成骨細(xì)胞基因表達(dá)
　　 分選后的細(xì)胞培養(yǎng)40 d時(shí),應(yīng)用MX300p定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),檢測A、B兩組細(xì)胞RUNX-2、OC、BSP mRNA的表達(dá)情況。
　　 6 礦化結(jié)節(jié)

14、形成能力的檢測
　　 分選后的A、B兩組細(xì)胞培養(yǎng)50 d時(shí)運(yùn)用Von Kossa's礦化結(jié)節(jié)染色法和茜素紅染色法檢測。
　　 二、結(jié)果
　　 1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原及分選
　　 CD34+/CD117+的細(xì)胞為A組,占總細(xì)胞量的40.2％,剩余混雜細(xì)胞為B組,占總細(xì)胞量的58.5％。
　　 2 細(xì)胞生長情況
　　 分選后的A、B兩組細(xì)胞與分選前的細(xì)胞形態(tài)并無太大差別,都是呈長梭形,

15、成集落狀生長,HE染色觀察見細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞輪廓清楚,體積較小,胞核呈卵圓形或圓形,著色深,胞漿著色淺。
　　 3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　 分選后A、B組的細(xì)胞分別制作細(xì)胞爬片,免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察發(fā)現(xiàn)A、B組細(xì)胞均有成骨細(xì)胞標(biāo)記物RUNX-2、OC、BSP的表達(dá)。
　　 4 熒光定量PCR技術(shù)檢測RUNX-2、OC、BSP mRNA的表達(dá)
　　 熒光定量PCR結(jié)果顯示A、B兩組細(xì)胞中均可檢測到R

16、UNX-2、OC、BSPmRNA表達(dá),且A組的表達(dá)量均高于B組。
　　 5 礦化能力的檢測
　　 A、B兩組細(xì)胞運(yùn)用Von Kossa’s染色法和茜素紅染色法檢測,結(jié)果顯示A組細(xì)胞呈陽性表達(dá),B組細(xì)胞呈陰性表達(dá)。
　　 三、結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)流式細(xì)胞儀分選可以獲得初步純化的CD34+/CD117+雙陽性表達(dá)的SHED。純化后的CD34+/CD117+雙陽性表達(dá)的SHED具有體外自行向成骨細(xì)胞分化和形