去分化脂肪細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞成骨成軟骨能力的比較研究.pdf

1、目的：比較兔去分化脂肪細(xì)胞(Dedifferentiated adipocytes，DA)和脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)在體外成骨及成軟骨的能力，為骨科組織工程中種子細(xì)胞的選擇提供依據(jù)。
　　 方法：①取4月齡新西蘭大白兔腹股溝脂肪組織，機(jī)械分離和酶消化法提取成熟脂肪細(xì)胞(Mature adipocytes，MA)和ADSCs。②天花板貼壁培養(yǎng)法誘導(dǎo)MA去分化，獲得DA。③將AD

2、SCs和DA以2×104個/ml接種到24孔板中，每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞增殖數(shù)量，取平均值通過Excel2007軟件繪制原代至第三代的生長曲線圖，計(jì)算兩種細(xì)胞增殖倍增時間。④選取第三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：ADSCs加入成骨誘導(dǎo)液(β-甘油磷酸鈉、VitC、地塞米松和含10％FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，設(shè)為Ao組，DA加入成骨誘導(dǎo)液，設(shè)為Do組；ADSCs加入成軟骨誘導(dǎo)液(胰島素、TGF-β1、VitC、轉(zhuǎn)鐵蛋白、

3、地塞米松和含10％FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，設(shè)為Ac組，DA加入成軟骨誘導(dǎo)液，設(shè)為Dc組，各組都設(shè)立空白對照組。各組細(xì)胞誘導(dǎo)第14天時，Ao組和Do組行成骨細(xì)胞茜素紅、Ⅰ型膠原免疫組化染色；Ac組和Dc組行軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)、Ⅱ型膠原免疫組化染色。⑤取各組培養(yǎng)第14天及第21的細(xì)胞，RT-PCR半定量檢測Ao組和Do組中Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)量，所得數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)行組間和組內(nèi)比較；同法檢測Ac組和Dc組中Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)量及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比較

4、ADSCs和DA成骨及成軟骨的能力。
　　 結(jié)果：①原代MA呈小圓形指環(huán)狀、形態(tài)規(guī)則，聚集分布。天花板貼壁培養(yǎng)后，MA中脂質(zhì)部分逐漸由細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脫出，由小圓形變?yōu)闄E圓形，最終變?yōu)殚L梭形成纖維細(xì)胞狀；原代ADSCs呈長梭形或小多角形，大小均勻并散在分布。②傳代培養(yǎng)后，兩種細(xì)胞亦呈長梭形、密集分布，“漩渦樣”生長。③原代培養(yǎng)時，細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測ADSCs對數(shù)生長期終末細(xì)胞數(shù)為5.9±0.41，DA為6.3±0.36，t檢驗(yàn)兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、差異(p>0.05)；傳代培養(yǎng)后，第一代、第二代和第三代的ADSCs及DA對數(shù)生長期終末細(xì)胞數(shù)差異不大(p>0.05)。兩種細(xì)胞倍增時間在58～61小時之間(p>0.05)，說明兩種細(xì)胞增殖能力相似。④Ao組和Do組茜素紅和Ⅰ型膠原免疫組化染色陽性，對照組陰性；Ac組和Dc組甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性，對照組陰性。⑤RT-PCR檢測第14天和第21天Ao組中Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)量為0.375±0.018、0.908±0.017，

6、Do組Ⅰ型膠原表達(dá)量為0.246±0.014、0.821±0.012，相同時間點(diǎn)Ao組表達(dá)量明顯高于Do組(p<0.05)，且Ⅰ型膠原表達(dá)量與培養(yǎng)時間成正比(p<0.05)；Ac組和Dc組中Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)量分別為0.316±0.027、0.458±0.020和0.204±0.024、0.377±0.021，Ac組中Ⅱ型膠原表達(dá)量也均明顯較Dc組高(p<0.05)，隨著培養(yǎng)時間的延長Ⅱ型膠原表達(dá)量增加(p<0.05)。兩種細(xì)胞空白對