維生素C誘導(dǎo)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞膜片形成及體外成骨實(shí)驗(yàn)初步研究.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用酶消化法培養(yǎng)獲得人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，并進(jìn)行分離、純化和鑒定，采用維生素C誘導(dǎo)法形成人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞膜片，探討其體外骨向分化能力，為人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞膜片臨床應(yīng)用打下臨床前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、分離純化、鑒定。
　　選取6～10歲健康兒童因滯留而拔除的乳牙，采用酶消化法獲得單細(xì)胞懸液，有限稀釋法進(jìn)行分離、純化，獲得人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞。測(cè)定細(xì)胞克隆

2、形成率，倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞倍增能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析其表面抗原CD146、CD90、SSEA-4、OCT-4等的表達(dá)情況。取生長(zhǎng)狀況良好的第三代人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，分別行堿性磷酸酶染色、茜素紅染色和油紅O染色，檢測(cè)成骨分化和成脂分化情況，鑒定其多向分化能力。
　　2.維生素C誘導(dǎo)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞膜片的形成及成骨分化能力檢測(cè)
　　將第3代人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，

3、在含20、50、80、100μg/ml維生素Cα-MEM培養(yǎng)液下誘導(dǎo)培養(yǎng)10-14天，以獲得能誘導(dǎo)形成完整的、連續(xù)的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞膜片的合適的維生素C誘導(dǎo)液濃度。細(xì)胞膜片成熟后，用細(xì)胞刮匙從培養(yǎng)皿邊緣完整的分離膜片，進(jìn)行組織學(xué)HE染色觀察。堿性磷酸酶染色、茜素紅染色觀察膜片成骨分化能力。RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)分子Runx2、OCN的基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.通過酶消化法和有限稀釋法獲得的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞

4、，倒置顯微鏡下呈巢式或集落狀生長(zhǎng)，細(xì)胞排列緊密，周邊細(xì)胞呈短梭形，體積較小。HE染色，光鏡下可見細(xì)胞呈梭形或多角形，細(xì)胞核大藍(lán)染，著色深，卵圓形，有一個(gè)或多個(gè)核仁，胞質(zhì)粉紅，著色淺。計(jì)算細(xì)胞克隆形成率為21-24個(gè)/103。流式細(xì)胞儀表面抗原檢測(cè)CD90陽(yáng)性細(xì)胞率為92.51％，CD146陽(yáng)性細(xì)胞率為42.5％，OCT-4+陽(yáng)性細(xì)胞率為41.57%，SSEA-4陽(yáng)性細(xì)胞率為18.3％。人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液的作用下，細(xì)胞復(fù)層生

5、長(zhǎng)，堿性磷酸酶染色可見部分細(xì)胞胞漿藍(lán)染，細(xì)胞誘導(dǎo)14天后可觀察到有鈣化結(jié)節(jié)逐漸形成，經(jīng)茜素紅染色呈橘紅色或紅色。在成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)28天后可見個(gè)別細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)高強(qiáng)度的折射點(diǎn)，油紅O染色呈橙紅色。
　　2.50μg/mL維生素C能誘導(dǎo)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞形成完整連續(xù)的細(xì)胞膜片，HE染色顯示獲取的細(xì)胞膜片較為均勻，細(xì)胞間富含大量的粉染的細(xì)胞外基質(zhì)。ALP染色顯示與空白對(duì)照組相比，維生素C誘導(dǎo)細(xì)胞膜片形成組，細(xì)胞藍(lán)染，著色基本一致，但較

6、成骨誘導(dǎo)組少。經(jīng)RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳可觀察到OCN、Runx2的mRNA在不同的培養(yǎng)條件下表達(dá)均升高，OCNmRNA在成骨誘導(dǎo)和維生素C誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，Runx-2mRNA在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和維生素C培養(yǎng)條件下較未誘導(dǎo)條件下表達(dá)升高(P<0.05)，維生素C誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下mRNA表達(dá)較成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.酶消化法和有限稀釋法分離獲得了人脫落乳牙牙髓干