維生素C誘導人脫落乳牙牙髓干細胞膜片形成及體外成骨實驗初步研究.pdf

1、目的：
　　應用酶消化法培養(yǎng)獲得人脫落乳牙牙髓干細胞，并進行分離、純化和鑒定，采用維生素C誘導法形成人脫落乳牙牙髓干細胞膜片，探討其體外骨向分化能力，為人脫落乳牙牙髓干細胞膜片臨床應用打下臨床前期實驗基礎。
　　方法：
　　1.人脫落乳牙牙髓干細胞的原代培養(yǎng)、分離純化、鑒定。
　　選取6～10歲健康兒童因滯留而拔除的乳牙，采用酶消化法獲得單細胞懸液，有限稀釋法進行分離、純化，獲得人脫落乳牙牙髓干細胞。測定細胞克隆

2、形成率，倒置顯微鏡下逐日觀察細胞的生長狀態(tài)及細胞倍增能力。流式細胞儀檢測分析其表面抗原CD146、CD90、SSEA-4、OCT-4等的表達情況。取生長狀況良好的第三代人脫落乳牙牙髓干細胞，進行成骨和成脂誘導，觀察細胞形態(tài)變化，分別行堿性磷酸酶染色、茜素紅染色和油紅O染色，檢測成骨分化和成脂分化情況，鑒定其多向分化能力。
　　2.維生素C誘導人脫落乳牙牙髓干細胞膜片的形成及成骨分化能力檢測
　　將第3代人脫落乳牙牙髓干細胞，

3、在含20、50、80、100μg/ml維生素Cα-MEM培養(yǎng)液下誘導培養(yǎng)10-14天，以獲得能誘導形成完整的、連續(xù)的人脫落乳牙牙髓干細胞膜片的合適的維生素C誘導液濃度。細胞膜片成熟后，用細胞刮匙從培養(yǎng)皿邊緣完整的分離膜片，進行組織學HE染色觀察。堿性磷酸酶染色、茜素紅染色觀察膜片成骨分化能力。RT-PCR檢測成骨相關分子Runx2、OCN的基因表達情況。
　　結果：
　　1.通過酶消化法和有限稀釋法獲得的人脫落乳牙牙髓干細胞

4、，倒置顯微鏡下呈巢式或集落狀生長，細胞排列緊密，周邊細胞呈短梭形，體積較小。HE染色，光鏡下可見細胞呈梭形或多角形，細胞核大藍染，著色深，卵圓形，有一個或多個核仁，胞質粉紅，著色淺。計算細胞克隆形成率為21-24個/103。流式細胞儀表面抗原檢測CD90陽性細胞率為92.51％，CD146陽性細胞率為42.5％，OCT-4+陽性細胞率為41.57%，SSEA-4陽性細胞率為18.3％。人脫落乳牙牙髓干細胞在成骨誘導液的作用下，細胞復層生

5、長，堿性磷酸酶染色可見部分細胞胞漿藍染，細胞誘導14天后可觀察到有鈣化結節(jié)逐漸形成，經茜素紅染色呈橘紅色或紅色。在成脂誘導液誘導28天后可見個別細胞胞漿內出現(xiàn)高強度的折射點，油紅O染色呈橙紅色。
　　2.50μg/mL維生素C能誘導人脫落乳牙牙髓干細胞形成完整連續(xù)的細胞膜片，HE染色顯示獲取的細胞膜片較為均勻，細胞間富含大量的粉染的細胞外基質。ALP染色顯示與空白對照組相比，維生素C誘導細胞膜片形成組，細胞藍染，著色基本一致，但較

6、成骨誘導組少。經RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳可觀察到OCN、Runx2的mRNA在不同的培養(yǎng)條件下表達均升高，OCNmRNA在成骨誘導和維生素C誘導培養(yǎng)條件下表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，Runx-2mRNA在成骨誘導培養(yǎng)和維生素C培養(yǎng)條件下較未誘導條件下表達升高(P<0.05)，維生素C誘導培養(yǎng)條件下mRNA表達較成骨誘導培養(yǎng)條件下升高(P<0.05)。
　　結論：
　　1.酶消化法和有限稀釋法分離獲得了人脫落乳牙牙髓干