纖維內(nèi)硅化膠原促人牙髓干細(xì)胞成骨分化的研究.pdf

1、腫瘤、骨質(zhì)疏松、創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎等多種原因?qū)е碌墓侨睋p一直嚴(yán)重影響著人們的健康和生活質(zhì)量。盡管自體骨移植被認(rèn)為是骨缺損的最佳修復(fù)方法,但是仍存在供體有限、手術(shù)創(chuàng)傷、并發(fā)癥較多、手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。而同種異體骨移植和異種骨移植,則由于免疫排斥、生物相容性較差等缺點(diǎn),在臨床應(yīng)用中受到了很大的限制。因此尋找理想的骨替代材料,成為了骨缺損修復(fù)面臨的重要難題。隨著研究的不斷進(jìn)展,近年來(lái)基于干細(xì)胞的骨組織工程已在骨缺損修復(fù)材料的研制方面取得一系列重要的

2、進(jìn)展。
　　為了實(shí)現(xiàn)功能化骨的再生,組織工程三大關(guān)鍵要素即種子細(xì)胞、支架材料和生物活性因子的選擇和整合至關(guān)重要。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的成骨分化潛能,并已經(jīng)在骨組織的重建再生方面得到了廣泛的研究,然而細(xì)胞獲取困難、費(fèi)用高昂、創(chuàng)傷較大等問(wèn)題限制了其在臨床中的應(yīng)用。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比,牙髓干細(xì)胞的獲取方法容易,獲取過(guò)程對(duì)患者造成的創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)小,具有更高的克隆形成能力,并且已有研究表明牙髓干細(xì)胞能夠分化為成骨細(xì)胞并形成骨組

3、織,因此牙髓干細(xì)胞有望替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,成為骨組織工程中理想的自體種子細(xì)胞。
　　除種子細(xì)胞以外,支架材料是骨組織工程的又一重要因素,常見(jiàn)的支架材料有金屬、陶瓷、天然聚合物和合成聚合物等,然而現(xiàn)有的材料仍無(wú)法滿足理想組織工程支架材料的要求。I型膠原為骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要有機(jī)成分,具有良好的生物相容性,是骨組織工程中常用的支架材料,但是易降解和機(jī)械性能較差等問(wèn)題成為其應(yīng)用的掣肘。為了解決這一問(wèn)題,本課題組在前期研究中在國(guó)際上首次實(shí)

4、現(xiàn)了重組I型膠原支架的纖維內(nèi)硅化,顯著提高了膠原支架的機(jī)械性能和耐酶解性,并且證實(shí)該支架材料能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,顯示了其在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。
　　然而纖維內(nèi)硅化膠原是否能促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的成骨分化,其分化特征如何,目前仍不清楚。因此本研究的目的是探索纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)牙髓干細(xì)胞成骨分化的影響,從而為纖維內(nèi)硅化膠原和牙髓干細(xì)胞在骨組織工程中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果
　　1.纖維內(nèi)硅

5、化膠原對(duì)人牙髓干細(xì)胞活性的影響
　　從人牙髓中分離牙髓干細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、克隆形成能力、干細(xì)胞表面標(biāo)志物等方面對(duì)細(xì)胞干性進(jìn)行鑒定;通過(guò)掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscopy,SEM)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和Propidiumiodide檢測(cè)細(xì)胞凋亡壞死情況,評(píng)估纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)細(xì)胞粘附、伸展及細(xì)胞凋亡壞死特性的影響;通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)含量測(cè)定

6、實(shí)驗(yàn),檢測(cè)纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖特性的影響。結(jié)果表明所分離培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞,克隆形成率為25％,間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90和CD105的表達(dá)為陽(yáng)性,造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD34和CD45的表達(dá)為陰性;纖維內(nèi)硅化膠原組、未硅化膠原組和空白對(duì)照組中正常人牙髓干細(xì)胞所占百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05);纖維內(nèi)硅化膠原組中人牙髓干細(xì)胞的DNA含量和S期細(xì)胞百分比均明顯高于未硅化膠原組和空白

7、對(duì)照組(p<0.05)。
　　2.纖維內(nèi)硅化膠原促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成骨分化的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)、蛋白免疫印跡、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色、ALP活性檢測(cè)、茜素紅染色和馮庫(kù)薩染色,從多個(gè)角度評(píng)估纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)人牙髓干細(xì)胞成骨分化的影響。結(jié)果表明,與未硅化膠原組和陰性對(duì)照組相比,纖維內(nèi)硅化膠原組中的成骨標(biāo)志基

8、因和蛋白成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(runt-relatedtranscriptionfactor2,RUNX2)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(osterix,OSX)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、ALP和I型膠原(typeIcollagen,COLI)的表達(dá)水平均明顯增高(p<0.05);纖維內(nèi)硅化膠原組中人牙髓干細(xì)胞內(nèi)ALP活性及礦化沉淀形成量明顯高于未硅化膠原組和陰性對(duì)照組(p<0.05)。

9、
　　3.纖維內(nèi)硅化膠原促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成骨分化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　分別構(gòu)建人牙髓干細(xì)胞與纖維內(nèi)硅化膠原及未硅化膠原的復(fù)合體,將各組細(xì)胞-支架復(fù)合體植入裸鼠皮下,8周后,進(jìn)行伊紅和蘇木精(hemotoxylinandeosin,HE)染色、茜素紅染色、馮庫(kù)薩染色和免疫組織化學(xué)染色,觀察骨樣組織的形成情況。結(jié)果表明,纖維內(nèi)硅化膠原組中骨細(xì)胞、血管和骨樣組織的形成均明顯多于未硅化膠原組和陰性對(duì)照組(p<0.05);纖維內(nèi)硅化膠原